[求助]流式细胞仪上机检测前的处理

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标题:[求助]流式细胞仪上机检测前的处理

am10[使用道具]
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发表于 2012-8-14 11:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位同仁，今天做了细胞凋亡的流式检测，我想问一下细胞用胰酶消化下来后　用ＰＢＳ洗后　　用酒精固定吗？　我今天固定了，上机检测前用ＰＢＳ　洗了两次　，上流式检测居然检测到的大部分是细胞碎片，可是马上涂片后确发现细胞有５乘十的五次方个，请问上流式前细胞要达到多少浓度？
还有流式操作成功的关键是什么　　谢谢

04906[使用道具]
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发表于 2012-8-14 11:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不太明白你的问题是什么.

偶一般固定细胞,如果是第二天上流式的话. 如果当天上流式,就不固定了.
偶一般用流式检测10000个细胞,所以只要够这个数就可以. 偶一般是1百万或半百万个细胞,最后是悬在100到150ul液体里面.
不知道你的FSC,SSC值设定正确吗.

S6044[使用道具]
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发表于 2012-8-14 11:46 资料个人空间短消息加为好友

小中大

上流式检测居然检测到的大部分是细胞碎片

我想不应该是你的细胞数不够,是碎片太多,从处理过程找原因,或者你的细胞在胰酶消化之前有很多死的.

园丁##[使用道具]
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发表于 2012-8-14 11:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

“上流式检测居然检测到的大部分是细胞碎片，”
与细胞浓度无关，流式自动计数吸入的细胞数。

am10[使用道具]
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发表于 2012-8-14 11:47 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我最近已经做了几次关于细胞凋亡的实验了，用流式细胞术检测的,用流式测细胞凋亡,样品的制备是关键,固定是必须的步骤,我用的是PI染色,细胞处理好后,用胰酶消化,收集于dorf管中,然后加70%终浓度的乙醇,3%小牛血清,混匀,-20度固定,样品固定一周都没问题,你可以加700ul无水乙醇,再加300ul10%的小牛血清,这样终浓度刚好.加小牛血清的目的是为了使细胞更好的分散,减少粘连，聚集,这样有利于细胞的上样,给检测带来方便,一般一个样品需要检测104个细胞,制备时细胞数要达到106,当然越多越好,利于检测,当天测固定1小时即可.PI只是一种很传统的检测凋亡的方法,凋亡峰中可能有坏死细胞,难以区分,只能说明凋亡的大概趋势,你看看以下的资料也许对你有帮助.
Annexin Ⅴ法是借助于对细胞膜外侧的磷酯酰丝氨酸(PS)的标记来进行流式细胞仪检测的。从细胞凋亡早期PS既由细胞膜内侧迁移至胞膜外侧,直到细胞坏死节段PS均暴露于细胞外表, Annexin+细胞既包含了凋亡细胞, 也包含了死亡细胞,为进一步把凋亡细胞分离出来，必须同时进行PI染色。但与PI检测方法不同，Annexin Ⅴ/PI检测法不加入Triton X-100和细胞固定剂，只有在死亡细胞中PI才能透过细胞膜使DNA染色，凋亡细胞（特别是早期凋亡细胞）则表现为PI低染，既Annexin+/PI-细胞为凋亡细胞，Annexin+/PI+细胞为死亡细胞。正常细胞PS在胞膜内侧，表现为Annexin-/PI-，细胞有机械性破损时，可出现Annexin-/PI+。由此可以看出，Annexin Ⅴ/PI双染检测法可区分正常细胞、凋亡细胞和死亡细胞，对细胞凋亡的检测更具有特异性。

yhz1973[使用道具]
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发表于 2012-8-14 11:49 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我这里做流式是不固定的，结果也差一样啊！还有你的碎片多是不是吹打得太厉害了？

缘yuan[使用道具]
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发表于 2012-8-14 11:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

楼上各位都说的有理！请楼主仔细分析！

还有一种可能：PBS有问题！（我们实验室就有这种情况发生过，只需要看看人家用这种PBS的结果就可以了！）

好运！

c86v[使用道具]
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发表于 2012-8-14 11:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

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发表于 2012-8-14 11:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

一. 碎片可能性有
1.细胞捶打过猛，导致正常细胞破裂损坏。
2.. 测凋亡原则上所有PBS、消化液等，都不要倒掉，一起离心收集。由于培养时间可能过长，可能培养瓶内会有很多已经死亡的细胞，经吹打可能会产生细胞碎片
3..细胞培养过程中产生很多非整倍体细胞，可能与培养条件不适有关。
二. 我上流式前处理：
1.PBS快速洗涤2次，胰酶消化细胞，800rpm离心10min，收集细胞。
2.弃上清，用0.2ml PBS重悬细胞，逐滴加入5-10ml 70％乙醇，在4℃固定8h以上，1500rpm离心10min。
3.弃上清，细胞沉淀用PBS洗2次，加入0.2ml PBS，加入终浓度为50微克/ml的RNase，37℃保温30-45min，冰浴1min。
4.加入终浓度50微克/ml的PI, 4℃避光染色30min。
如果不立即检测，70%乙醇固定后，短期放在4度或长期放在-20度保存。

qqq111[使用道具]
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发表于 2012-8-14 11:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

各位同仁，今天做了细胞凋亡的流式检测，我想问一下细胞用胰酶消化下来后　用ＰＢＳ洗后　　用酒精固定吗？　我今天固定了，上机检测前用ＰＢＳ　洗了两次　，上流式检测居然检测到的大部分是细胞碎片，可是马上涂片后确发现细胞有５乘十的五次方个，请问上流式前细胞要达到多少浓度？
还有流式操作成功的关键是什么　　谢谢

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楼上许多分析的有些道理。但有两点没有提到。
1. 楼主应当用胎盘兰染色后看看死细胞的比例。如果大部分都是死细胞，那么流失检测到的的确是些细胞碎片。但如果看到的只是个别细胞死亡，那要注意下面的问题。
2. 我不知道楼主如何从流式上判断细胞碎片。流式操作时要调整FSC和SSC等参数的增益，也就是电压。如果增益小，细胞对在散点图的左下角，就被认为是碎片。所以，放大增益，使得各个event在散点图中的分布分散开来，左下角的仍然是细胞碎片。这一点不知楼主注意到没有。还有，细胞在固定后，体积可能要小一些，在同样的增益值下，偏向左下角，也容易当成细胞碎片。