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标题:[讨论帖]关于96孔板铺细胞的几个问题

yychen[使用道具]
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发表于 2012-8-14 11:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[讨论帖]关于96孔板铺细胞的几个问题


我的实验室经常做mtt,我的问题是细胞铺不匀,今天已经看过以前大家发的有关96孔板铺细胞的问题了,可是还是有疑问,想结合自己的经验拿来与大家讨论一下:
1, 我觉得稀释前把细胞吹匀很重要,但是吹的时间长会不会对细胞有损伤呢?
2, 如果一次是铺一个板的话,稀释好的细胞悬液一般是10ml,这时候吹细胞用枪是不可能的了,我用2ml的吸管吹过,觉得劲很大,不太好使就改用那种有又长又细嘴的滴管吹(听师兄说好象是专门用来吹细胞的),结果吹了至少有十几下,就铺板了,我们是拿枪加,每孔100ul,可是后来加完觉得好象还是不匀加的过程中也有摇晃,看有人说加的过程中也要吹<可是那样要增加很多操作,会不会污染啊?吹的时候是不是不把吹管拿出来,加几个孔就吹两下这样子啊?
3. 有很多人建议用排枪,我们有排枪,可是没有那个配套的装细胞悬液的艚啊?请问有人知道在哪卖吗多少钱啊?有人建议用96孔板的盖子,（我门加DMSO的时候是用那个)可是那个盖子装的了10ml 的液体吗??而且面积那么大很不好操作啊感觉?希望有用盖子操作的前辈指点一下,仔细介绍一下实验操作!谢谢
4, 铺完板后到底要不要晃呢?或者在机器上振荡??有人说要晃,有人说千万不要晃!我的唯一经验是如果振荡好象细胞很容易集中到中间,长成驮,几天长成两层,可是不晃细胞好象很容易在四周.所以不知道到底要怎么办>我猜想是不是跟振荡的时间和力度大小有关呢??
5 关于细胞浓度的问题:我铺板用的是最普通的HELA细胞,稀释成1*10^4,每孔100ul,等于每孔是1000个细胞,可是我按这个稀释加进去的细胞都有点少,通常对照才能长到0.7-0.8的样子,,处理数据最郁闷的就是加了药的比对照长的还好,我细胞是不是铺的太少了??吹细胞的管子会影响我的细胞个数吗?
6 最后讨论一下加DMSO 的问题,我们实验室有两中DMSO 一种是进口的,一种国产的,最后加DMSO 的时候都是用国产的,用排枪加,听同学说加进口的那种跟国产的颜色不一样,不知道这个会不会很影响实验结果??
7 加的药有颜色应该不会很影响实验结果吧?不知道大家最后倒掉mtt加DMSO之前里面剩的液体要怎么处理?我们是倒置在卫生纸上吸一下,我有试过用书上的方法用滤纸小心的吸里面的液体,感觉会很容易吸到里面兰色的孔底的东西,害怕把细胞给弄下来,所以只好放弃.
8 感觉影响mtt的结果的因素太多了!希望做的好的有经验的前辈可以给点意见!!刚开始做实验,不知道说的对不对,希望大家都来讨论哈!!!
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bohe221[使用道具]
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发表于 2012-8-14 11:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
5 关于细胞浓度的问题:我铺板用的是最普通的HELA细胞,稀释成1*10^4,每孔100ul,等于每孔是1000个细胞,可是我按这个稀释加进去的细胞都有点少,通常对照才能长到0.7-0.8的样子,,处理数据最郁闷的就是加了药的比对照长的还好,我细胞是不是铺的太少了??吹细胞的管子会影响我的细胞个数吗?

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个人感觉你接种浓度小了！一般而言，肿瘤细胞都用5*10^4，200ul/每孔，接种。你可以算一下，你接种的细胞数少了一个数量级的。而且，Hela细胞体积有点大，细胞数你可以相对往下调整一下。细胞数少，是你结果偏小的主要原因，这样误差就更大了，不利于分析的。
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发表于 2012-8-14 11:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
6 最后讨论一下加DMSO 的问题,我们实验室有两中DMSO 一种是进口的,一种国产的,最后加DMSO 的时候都是用国产的,用排枪加,听同学说加进口的那种跟国产的颜色不一样,不知道这个会不会很影响实验结果??

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这个应该影响不大，而且你每次都是用国产的，就可以消除这种差别的。但要注意，加DMSO后，反应时间长短，将会影响检测结果的。所有每次操作最好控制差不多相同的时间。
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bohe221[使用道具]
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发表于 2012-8-14 11:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
7 加的药有颜色应该不会很影响实验结果吧?不知道大家最后倒掉mtt加DMSO之前里面剩的液体要怎么处理?我们是倒置在卫生纸上吸一下,我有试过用书上的方法用滤纸小心的吸里面的液体,感觉会很容易吸到里面兰色的孔底的东西,害怕把细胞给弄下来,所以只好放弃.

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加的药有颜色会影响检测结果的，而且用的是不是同一批96孔板也会影响检测结果的。

加DMSO之前，我一般是用枪吸出里面的液体，将96孔板稍稍倾斜，用刚好是你加液量的枪容量去吸，一般不会吸出来孔底的兰色结晶。比如：加200ul的细胞悬液，吸的时候枪的容量就调到200，不要用1000的容量去吸！

祝实验顺利！
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发表于 2012-8-14 11:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做过几次MTT，试着解答你的几个问题，共同讨论：
1, 我觉得稀释前把细胞吹匀很重要,但是吹的时间长会不会对细胞有损伤呢?
答：细胞吹匀很重要，吹得时间过长对细胞也有损伤。原因一是机械损伤，二是长时间将培养液暴露在空气中，会变碱，细胞耐酸不耐碱，应该算是化学损伤。

2, 如果一次是铺一个板的话,稀释好的细胞悬液一般是10ml,这时候吹细胞用枪是不可能的了,我用2ml的吸管吹过,觉得劲很大,不太好使就改用那种有又长又细嘴的滴管吹(听师兄说好象是专门用来吹细胞的),结果吹了至少有十几下,就铺板了,我们是拿枪加,每孔100ul,可是后来加完觉得好象还是不匀加的过程中也有摇晃,看有人说加的过程中也要吹<可是那样要增加很多操作,会不会污染啊?吹的时候是不是不把吹管拿出来,加几个孔就吹两下这样子啊?
答：我觉得不是增加操作就会污染，我通常是加完一排孔会吹几次。
4, 铺完板后到底要不要晃呢?或者在机器上振荡??有人说要晃,有人说千万不要晃!我的唯一经验是如果振荡好象细胞很容易集中到中间,长成驮,几天长成两层,可是不晃细胞好象很容易在四周.所以不知道到底要怎么办>我猜想是不是跟振荡的时间和力度大小有关呢??
答：我通常是上下轻轻震动几次，细胞四周生长对药物要比中心多层积聚生长敏感一些
5 关于细胞浓度的问题:我铺板用的是最普通的HELA细胞,稀释成1*10^4,每孔100ul,等于每孔是1000个细胞,可是我按这个稀释加进去的细胞都有点少,通常对照才能长到0.7-0.8的样子,,处理数据最郁闷的就是加了药的比对照长的还好,我细胞是不是铺的太少了??吹细胞的管子会影响我的细胞个数吗?
答：你的细胞数的确不多，24hMTT时，我通常种到10000个/孔左右，因为细胞数少，细胞可能不处于对数生长期，不能反映正常的对药物的作用。如果细胞数过多也不行，因为细胞数过多，药物浓度达不到饱和，实际药物浓度和你设计的药物浓度不一致。所以细胞数要有你药物作用的时间和细胞的实际情况灵活决定。
6 最后讨论一下加DMSO 的问题,我们实验室有两中DMSO 一种是进口的,一种国产的,最后加DMSO 的时候都是用国产的,用排枪加,听同学说加进口的那种跟国产的颜色不一样,不知道这个会不会很影响实验结果??
答：不要一次用国产的，一次用进口的，一直用一种就可以啦，颜色不一样没有很大影响，MTT最后求的是细胞存活率，趋势应该是一样的

7 加的药有颜色应该不会很影响实验结果吧?不知道大家最后倒掉mtt加DMSO之前里面剩的液体要怎么处理?我们是倒置在卫生纸上吸一下,我有试过用书上的方法用滤纸小心的吸里面的液体,感觉会很容易吸到里面兰色的孔底的东西,害怕把细胞给弄下来,所以只好放弃.
答：药物有颜色可能会对结果有影响，因为你不知道药物在490nm或570nm时的光吸收值有多少，对照如果也用有同样颜色的溶剂作对照可以减少影响。我从来没有倒掉过MTT，我都是用移液器吸的，加多少吸出多少，移液器头贴近孔壁的下缘，基本上剩不下什么液体拉。
8 我自己还总结一个小窍门，就是如果你是横着加细胞的话，不妨试着竖着加药，至于为什么，你动脑筋想一想吧。
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发表于 2012-8-14 11:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.装细胞悬液的容器叫V型加样槽，可以高压灭菌，重复使用，一个25元。
2.hela细胞在96孔里接种的密度大约是3*10^4，这样如果培养48-72h密度刚好。我做过试验验证。
3.为了防止细胞在孔里生长不均，可以提前把96孔板放进培养箱几个小时，然后再取出加细胞，加后 静置5分钟，再放入培养箱。
4.最后是吸出培养液和药物混合液，然后才加MTT，所以药物颜色应该不会对实验结果造成影响。
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 小中大

谢谢各位前辈给我的回帖和建议!!."为了防止细胞在孔里生长不均，可以提前把96孔板放进培养箱几个小时，然后再取出加细胞，加后 静置5分钟，再放入培养箱。"这是为什么啊?呵呵,有人知道原因吗?
为什么要提前放进去呢?
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发表于 2012-8-14 11:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们实验室用的是VWR的这个， 叫做reagent reservoir，$88.34/200个。
应该是一次性的，不过我们也重复用几次，酒精冲洗后紫外线消毒过夜。
cuturl('http://www.vwrsp.com/catalog/product/index.cgi?object_id=0065154&resultNum=0')

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1.装细胞悬液的容器叫V型加样槽，可以高压灭菌，重复使用，一个25元。
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 小中大
8 我自己还总结一个小窍门，就是如果你是横着加细胞的话，不妨试着竖着加药，至于为什么，你动脑筋想一想吧。

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请指教，我觉得加药应该垂直于液面的中心加啊！！
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yychen[使用道具]
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发表于 2012-8-14 12:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
8 我自己还总结一个小窍门，就是如果你是横着加细胞的话，不妨试着竖着加药，至于为什么，你动脑筋想一想吧。

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这个我想了很久也没想出来
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