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标题:[求助]了解脂肪间质细胞/脂肪干细胞/ADSCs的请进

leifengta[使用道具]
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1
 

[求助]了解脂肪间质细胞/脂肪干细胞/ADSCs的请进


我做的是脂肪间质细胞培养,方法如下:
取人皮下脂肪,含2抗的PBS清洗,剪取无血管的小块脂肪组织,在西林瓶中剪碎,大概有5毫升脂肪的样子,(发现脂肪组织不好剪碎,有什么技巧呢?剪多久?),剪碎后置于50毫升离心管内,加入2倍体积的0.075%的一型胶原酶,消化。
我试过
1.室温下消化30分钟,间断手摇振荡。
2..培养箱(37度)内消化1个小时,间断拿出来振荡。
3.37度水浴箱消化30分钟,45分钟,90分钟,间断拿出振荡。
4.空气恒温37度摇床低频率振荡消化90分钟。
消化后加入等体积DMEM/F-12,1200转10分钟,倒去上层漂浮的脂肪,取沉淀用培养基重悬,200目筛过滤,滤液再离心,培养基重悬后,玻璃培养瓶/塑料瓶培养,培养基为DMEM/F-12+10%FBS+双抗。
以上方法都没有贴壁的细胞,很是烦恼。
我发现离心后上层的脂肪块好像没什么变化,你是怎么判断消化程度的呢?或许我的酶有问题。培养的时候感觉有很多红细胞,我没有用氯化铵裂解.
各位可以辨认刚培养前的干细胞吗?单个核细胞?

现在没有贴壁成功,甚是苦恼.非常感激战友可以指出失败原因,恳请传授经验.能提供详细的操作技巧.
万分感激!
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toy[使用道具]
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我觉得有几点应该注意:
1、胶原酶浓度太低了,我作地大鼠原代用的1mg/ml的胶原酶。
2、消化后加培养基准备离心的时候,要用滴管反复吹打,把消化下来的细胞吹打下来,然后在离心,吹打这步很重要,不吹打是没有细胞的。
3、消化程度不大好说,最好让脂肪颗粒变成粘稠状。不过我很少达到。我消化的时候是放在37度120转每分钟90分钟。
4、培养前的细胞不好辨认,只好12-24小时贴壁后才能分辨,因为血细胞太少了。
5、至于剪碎的问题多剪就可以了,到一定程度就没法剪了。呵呵
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leifengta[使用道具]
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1.关于浓度,本版其他的战友也认为0.075%是低了,他们的都比较高。我下一步准备提高浓度,但消化时间是不是做什么调整?还是有其他依据?
2.你的第2个建议很好。
但我有一次是用摇床摇的,就是 摇细菌的空气恒温的。大概频率是100, 隔5分钟加速到300摇十几秒,应该说细胞会沉到下面的。摇了90分钟。不过我准备按你的方法做一下。
另,有的战友说离心前不要加培养基,加PBS可以提高细胞量。战友说血清不能中和胶原酶。一般的文献也是没有提到可以中和,也认为胶原酶对细胞每那么大的损伤。但,我在一篇Zuk PA的文献里看到一句话说可以中和。(他很多关于脂肪干细胞的文章)。
3.消化程度真的比较麻烦。国外清一色的0.075% 30分钟的消化,大多都是参照Zuk PA.2001的,还有就是Gimble J的,他们俩的文章占了大多数。我看过一个0.03%浓度3个小时的。
你认为消化时间是不是没那么严格的限定时间,考虑到酶的每批次的比活性和厂家。据认为现用现配 ,可这样操作比较麻烦,你是怎么处理的?
4.培养前不裂解的话,举目都是红细胞,所以按细胞计数培养就不现实。
你是怎么考虑的呢?我是5 毫升脂肪组织的细胞量放一个25 cm培养瓶。
真不知道老外是怎么计数的,他们怎么分辨单个核细胞!
加裂解液您试过吗?大多数人都不主张所以我也没用,并且我有一个疑问:室温下裂解10分钟,再离心。显然离心总得有5分钟,那么那个10分钟包括这个5分钟吗?文献书籍都未说明。而司徒镇强编的书是说作用4-5分钟。
5.剪碎的问题。
开始我是在平皿里剪,不爽,用不上力,后来先剪成 大概4*3*3的大小,再放到西林瓶里剪。有一个疑问,如果剪的时间比较长,对细胞是否机械损伤大呢?你的实践如何?
再:
6.您是用多少目的网过滤的?老外的是100微米血液过滤尼龙网,合计大概就是140目左右(没有固定换算公式,有厂家的表格),他们说的网我是没找到哪里有卖,我先是用带框的200目的筛网,还来觉得麻烦,买了200目的大网,剪成小块,每次用完就扔了。您是用啥宝贝呢?
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whitesheep[使用道具]
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1.我的胶原酶是20mg溶解于20ML的DMED培养基。
2.裂解液我没用过,不过考虑用,因为红细胞太多了。
3.剪细胞时,我用的是进口20ML的西林瓶,国产的有腊。剪时我是剪的很碎,怕不好消化。时间长短估计没什么影响吧
4.筛网我用的 250目,书上说100目去组织,250目去脂肪细胞,我用过200目的,感觉的确比250目的脂肪细胞多,可我们要的可是前脂肪细胞呀。
我想问个问题,胶原酶配置的时候PH值多少合适??我得好像7.0左右,
而且,我的细胞分化率不是太高,请教原因。
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我做的是猪preadipocyte 原代培养,出现问题如下:
1、部分细胞没有诱导就已经分化了,郁闷!如何控制?
2、未分化的脂肪前体细胞如何鉴别?
3、我已经传了近10代了,我想问一个弱智的问题:用传代后的细胞作实
验,算不算原代培养!


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2012-8-14 12:13
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leifengta[使用道具]
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QUOTE:
原帖由 skytree 于 2012-8-14 12:13 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

我做的是猪preadipocyte 原代培养,出现问题如下:
1、部分细胞没有诱导就已经分化了,郁闷!如何控制?
2、未分化的脂肪前体细胞如何鉴别?
3、我已经传了近10代了,我想问一个弱智的问题:用传代后的细胞作实
验,算不算原代培养!  ...

3.原代培养也叫初代培养,是从供体获取组织后的首次培养。优点是:组织和细胞刚刚离体,生物性状尚未发生很大的变化,具有二倍体遗传性状,在供体来源充分,生物条件稳定的情况下(年龄,性别),在一定程度能反映体内状态。
原代培养细胞的改变,主要是表型上的改变,不一定为体细胞突变。从理论上说,人们有可能创造出一种条件,使原代培养的细胞恢复体内时的功能,因此原代培养细胞是研究基因表达的理想系统。采用原代培养细胞做实验,如药物测试等效果很好,原代培养也是建立各种细胞系的(株)的必经阶段。
但原代培养的细胞是由多种细胞组成的,即使培养的是比较单一类型的细胞,如上皮和成纤维细胞,也存在异质性,在分析细胞生物学特性时仍有一定的困难。

传代培养就是因为细胞的生长的接触抑制(贴壁的),当长满物理空间时进行分离,以继续培养。

觉得你的问法有点拗口。
如果你的工作是从猪身上取了脂肪前体细胞的话,你的实验过程当然包括了---原代培养。
按你的话推测,你好像是准备用你传了几代的细胞做相关实验。但你的实验的名字不是--原代培养吧。
原代培养只是你的实验的一部分。
这样的话,使用哪一代的细胞做实验就看你的实验设计了。细胞在培养传代过程中或多或少的会改变的。一方面要对原代的细胞纯化(方法多样),一方面要选择合适的时机施加实验干预:比如做干细胞的诱导,有的是选第3/4代的;做干细胞鉴定要尽量纯化。
看你的实验要求了。

而脂肪前体细胞有现成的细胞系的----3T3-L1。你用它来做,你的实验过程就不包含什么原代培养了。

2.鉴定方式文献应该有的!

1.不知道你是怎么分离,你的培养天条件所以不好回答。

因为我的实验也是关于脂肪的,但我要的是脂肪间质细胞,相信你对此也有了解。我的分离方法就是普通的离心,原理是含有脂滴的成熟细胞和含有部分脂滴的脂肪前体细胞密度小会浮在上层。好像,要获得脂肪前体细胞是要密度梯度离心吧。
我一次实验,偶然获得少许和你的照片的类似的细胞---在我的上次发言中说了。但我没照也没做脂肪染色。
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