[求助]关于用氧化敏感探针DCFH-DA检测细胞内ROS

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标题:[求助]关于用氧化敏感探针DCFH-DA检测细胞内ROS

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发表于 2012-8-14 12:54 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做细胞内活性氧的检测，用氧化敏感的荧光探针DCFH-DA。它能穿过细胞膜进入细胞内，与ROS反应可转变为发出荧光的DCF。通过检测荧光强度可以间接反映细胞氧化应激的程度。请问各位大侠我用什么仪器定量检测荧光强度比较好？我曾试图用96孔板种细胞，抚育24小时后染色，再加激发ROS生成的试剂，最后通过荧光分光光度剂读数，但效果不理想。用荧光显微镜看，发现整个背景都是绿色，细胞很少。这是什么原因？谢谢！用流式细胞仪可以吗？

u234[使用道具]
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发表于 2012-8-14 12:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

应该用激光共聚焦显微镜检测

u234[使用道具]
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发表于 2012-8-14 12:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

具体的分子探针公司有很详细的操作说明的啊

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发表于 2012-8-14 12:55 资料个人空间短消息加为好友

小中大

活性氧的检测采用荧光探针DCFH-DA是常用的方法。你可以测定细胞上清液的荧光强度，用荧光分光光度计就可以。细胞内的，可以将上清液倒掉后，PBS冲喜三遍后，将细胞消化下来或用刮匙刮下来再到荧光光度计上测定。用流式细胞仪当然可以，具体的方法你可参阅有关文献，在此不再赘述。

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发表于 2012-8-14 12:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

目前,我也正在做有关细胞内氧化应激的检测,建议你用流式细胞术,细胞处理好后,一般是加终浓度为10umM的DCFH,有的细胞系此浓度可能太低,具体条件你还得试一试,37度孵育30分钟,pbs缓冲液洗两边,胰酶消化,然后收集于dorf管中,然后用含3%小牛血清的pbs0.5ml重悬细胞,这样就可以上机检测,(加小牛血清的目的是为了减少细胞粘连,聚集,增加单细胞数目,容易上样),流式细胞仪对细胞数目有一定的要求,一般106,你用六孔板,数量可以保证.

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发表于 2012-8-14 12:56 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢几位提供的信息。我也想用流式细胞仪做。请问,可不可以对细胞悬液直接染色，然后再分成几组加不同处理方式，最后上机测试？DCFH-DA你是用PBS稀释还是用培养基稀释？为什么加小牛血清的PBS可以减少细胞的粘连和聚集？
望赐教，谢谢！

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发表于 2012-8-14 12:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不可以的,一般都是细胞处理完后才染色的,DCFH先是拿DMSO溶解,然后再用PBS稀释到所需浓度,DMSO的终浓度只要不超过0.5%,对细胞没有多大损伤.加小牛血清的PBS可以减少细胞的粘连,这也是借鉴别人的经验,在做细胞凋亡,检测DNA含量,分析周期时,在细胞用70%的乙醇固定时,最好加终浓度3%的小牛血清,这可能是因为血清在乙醇的作用下析出的血清蛋白,将细胞包裹在血清蛋白中,使细胞相互不容易直接接触,也可能是血清蛋白被固定在细胞膜上,从而降低细胞黏附性的缘故.DCFH染色的细胞,要上流式，我用了血清发现效果要比不加血清的好，你可以试试，以上仅愚建供参考。

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发表于 2012-8-14 12:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢，再问一下是贴壁细胞染色效果好还是悬浮细胞染色好？因为要上流式，所以我觉得如果细胞悬液直接染色的话更方便的。另外，我看一些资料上说如果处理时间超过2个小时，应该先处理，再染色。如果处理时间不超过2小时应该先染再处理。不知道你的处理时间是多长？因为ROS产生后可能会很快代谢掉，所以我觉得先染，让DCFH-DA装载进细胞，再处理可以更好反映细胞氧化应激的情况，你认为呢？

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发表于 2012-8-14 12:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

大家来讨论讨论啊。我用过氧化氢处理细胞后检测细胞内氧化应激，但比对照组的荧光强度还弱些，这是什么原因啊？

zsxan1990[使用道具]
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发表于 2012-8-14 12:57 资料个人空间短消息加为好友

小中大

大家好:
我想用DCFH-DA测定精浆ROS的含量,你们说,我用DCFH-DA可以吗?它是不是只能用于细胞内检测呀?!
盼望中!!!

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