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标题:[求助]腺病毒感染293！

eric930[使用道具]
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发表于 2012-8-14 13:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]腺病毒感染293！


我用腺病毒重组质粒转染293后产生很好的绿色荧光，收病毒后再感染293就没有荧光出现，请问各位老师是什么原因？应该怎么改进？？急盼回信
先谢了!!
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gemei0115[使用道具]
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发表于 2012-8-14 13:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

很简单，同源重组没有成功，你转染的是穿梭质粒，在293细胞内没有产生病毒，因为GFP是在穿梭质粒上，所以即使没有重组成功，他也会在细胞里表达荧光。
解决办法：重新同源重组，鉴定正确确实重组成功，再取4ug重组质粒，Pac I酶切后乙醇沉淀，双蒸水重溶，脂质体转染。
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2012-8-14 13:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我想你的结果也与包装效率 、感染效率有关系吧！

不知道你的实验室怎么做的，中间有什么步骤可以监测效率么？

比如同时包装luc 测定luciferase值，或者有个筛选过程！
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eric930[使用道具]
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发表于 2012-8-14 13:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我可以确定已经同源重组了。穿梭质粒和重组质粒用pac1比较过了，已经转染过多次了。都没包装出有感染性的病毒，呜呜

我的转染效率就是靠绿色荧光蛋白监测，但有荧光不一定有病毒，感染后没有荧光了就是没包装出病毒吧
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eric930[使用道具]
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发表于 2012-8-14 13:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我可以确定已经同源重组了。穿梭质粒和重组质粒用pac1比较过了，已经转染过多次了。都没包装出有感染性的病毒，呜呜
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caihong[使用道具]
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发表于 2012-8-14 13:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我认为你的问题不是没有同源重组上，而是在于包装环节上，腺病毒包装设计到好多方面。
1. 293细胞是否为低代数；
2.Pac I酶切是否完全；
3. 酶切后是否去除内毒素；
4. 助燃效率是否高；
等等方面。建议你注意以上几个环节，一般可以解决。
祝你成功
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lixi559[使用道具]
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发表于 2012-8-14 13:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

感染以后没有荧光就肯定没有病毒，你的293细胞有没有问题？转染10天左右出现CPE了吗？还有，你收获病毒在感染以后没出现荧光，2-3天时细胞有无变化？ 你在北京吗？
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eric930[使用道具]
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发表于 2012-8-14 13:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的293的代数不是很低，但别人用同样的方法和细胞已经包装出来了，荧光很亮，收得的病毒可以感染靶细胞，唯独我的不行。转染48小时荧光就很好了但一直没有增多，第七天有好多细胞飘起就收了。Pac I酶切完全； “助燃效率”是什么意思？
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lixi559[使用道具]
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发表于 2012-8-14 13:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是转染效率，另外你酶切后去除内毒素没有
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eric930[使用道具]
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发表于 2012-8-14 13:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我们实验室都是用PEG法大提质粒，pac1酶切试剂盒切胶回收做转染，别人也没有特别去除内毒素结果很好。内毒素对包装病毒很关键吗？
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