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标题:[求助]紧急求助分离白细胞问题

dotaaa[使用道具]
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发表于 2012-8-21 14:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]紧急求助分离白细胞问题


我是采用淋巴细胞分离液--Ficoll液分离小鼠血液中的白细胞，然后提取白细胞中的RNA用于PCR，

请问Ficoll液也要用DEPC水处理吗？

我是买的现成的分离液，不知道厂家是不是用了DEPC水处理过，如果我买Ficoll粉剂自己再用DEPC水配置恐怕不好掌握并达到Ficoll液的密度1.077±0.001，我该如何处理呢？

淋巴细胞分离液--Ficoll液中能不能直接加DEPC至终浓度0.1%，然后高压高温30min呢？？

有做这方面的高手指点一下，谢谢！！
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october7[使用道具]
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发表于 2012-8-21 14:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不知道你做RT-PCR是为了什么,假如不是扩增全长,我觉得不需要,因为RNA是在你细胞内的,只要你分离的过程不破坏细胞,应该不会有太大影响.另外可以买进口的Percoll液体,用DEPC水处理的0.15M和1.5M的NaCl稀释应该可以的.
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发表于 2012-8-21 14:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我提RNA后，RT-PCR只扩增一部分目的基因，请问RNA酶不也是在细胞内吗？怎么不会降解？我是菜鸟，不懂降解是怎么样的过程
另外分离WBC时，我是用到低渗方法裂解RBC，也都用了DEPC水配的，请问裂解过程中怎么才能更好的保护WBC呢？
另外问一下各位全血离心后，你们一般怎么用什么管子吸取WBC呢？有的用毛细管、有的用塑料吸管，或者枪头等，我用的是塑料吸管效果不理想啊！
请高手指点 谢谢
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 小中大
不知道你做RT-PCR是为了什么,假如不是扩增全长,我觉得不需要,因为RNA是在你细胞内的,只要你分离的过程不破坏细胞,应该不会有太大影响.另外可以买进口的Percoll液体,用DEPC水处理的0.15M和1.5M的NaCl稀释应该可以的.

————————————————————————————————————————————————

你的意思是说用DEPC水处理的0.15M和1.5M的NaCl稀释Ficoll粉剂吗？请问浓度怎么掌握啊？谢谢
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jkobn[使用道具]
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发表于 2012-8-21 14:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你的意思是说用DEPC水处理的0.15M和1.5M的NaCl稀释Ficoll粉剂吗？请问浓度怎么掌握啊？谢谢

————————————————————————————————————————————————————————————————

自己配制的Ficoll溶液分离白细胞的效果不如淋巴细胞分离液，因为淋巴细胞分离液是用泛影葡胺和Ficoll混合配制的，其黏度较小，且有合适的渗透压。
正常细胞内的RNA酶是受到限制的，所以只要在分离细胞后使用DEPC水，应该可以保证RNA不被降解。
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发表于 2012-8-21 14:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼上的指点
请问在分离WBC的“过程中”用到的其他液体是不是应该要用DEPC水配置呢？
谢谢你
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发表于 2012-8-21 14:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

Percoll浓度稀释可以按照说明书进行,我不知道Ficoll的稀释怎样,应该有稀释与比重之间的关系的,你应该可以查到!
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dotaaa[使用道具]
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发表于 2012-8-21 14:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
估计上面的问题问的太菜了 别B4我啊
为了安全起见，除了分离液及吸取白细胞用的软管（检验科用的那种）目前其他试剂我都用DEPC水配置，不知道这样做合不合理呢？
对这方面实在不懂，心理特没底，忠心希望各位指点我一下我
谢谢
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小螺号[使用道具]
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发表于 2012-8-21 14:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

完全没有任何必要，只要在你的白细胞裂解后采用无RNA酶的手段就可以了，前期没有必要，否则所有作RNA的试验不是都要从前期开始处理了，那实验室没有东西可以用了，不用担心，我最近刚做过，一点问题都没有
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pengke1983[使用道具]
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发表于 2012-8-21 14:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

正如楼上群友所说的“自己配制的Ficoll溶液分离白细胞的效果不如淋巴细胞分离液，因为淋巴细胞分离液是用泛影葡胺和Ficoll混合配制的，其黏度较小，且有合适的渗透压。”
在提取RNA时，第一步用购买的淋巴细胞分离液即可，它不用做任何处理。
但在以后的每一步的试剂和所用的EP管、玻璃管、枪头等均需用0.1%DEPC配置和处理。最后的RNA溶解用0.01%的DEPC水。
吸取白膜层，若是玻璃管时则用细头吸管最好；若是EP管时用200ul枪头即可。
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