小中大[求助]请大家帮我看看我的角质形成细胞为什么不贴壁
【求助】请大家帮忙看看，到底哪里出现问题了。
先是鼠尾胶原的提取。
1.鼠尾胶原制备过程
取重约250g大白鼠一只，从鼠尾根部剪断鼠尾，刷洗干净后，置75％酒精中浸泡30min。无菌条件下将鼠尾切成约1.5cm的小段，逐一剥去毛皮，用有齿啮镊抽出尾腱置平皿中。剪碎尾腱，移至装有60ml 2％（我试过150ml0.1％冰箱里放置时就分层了，60ml 2％刚好一根鼠尾全溶，在冰箱里呈稠状液体）消过毒（高压，第一次过滤效果没高压好）的醋酸溶液的广口瓶中浸泡，密封好瓶口，置4℃冰箱中，间或振摇。1w后，移入灭菌离心管中,离心（4000r/min）30min。吸取上清液分装入小瓶，于－20℃冰箱内保存。
铺瓶：吸少量鼠尾胶原平铺培养瓶全覆盖贴细胞面，37℃过夜，吸取培养瓶内多余鼠尾胶原，置超净工作台，室温，开抽滤，紫外晾干后，使用时用培养基洗去多余胶原。已经用培养基试过，此批鼠尾胶原没污染。
2。角质形成细胞的分离
医院取包皮置于D-Hanks液中取回，用碘酊搽后酒精再搽，然后就剪成1cm*1cm方块泡双抗1小时，后加dispase4℃消化近20小时，分离表皮真皮，表皮剪碎置于胰酶－EDTA（3倍体积）37℃，消化30分钟，DMEM全培养基终止消化，200目筛过滤，离心1000转10分钟，弃上清，再加入DMEM全培养基吸管吹打细胞，再过滤离心，弃上清后加全培养基吹打细胞后放入已铺胶原的培养瓶中培养，5天后，竟然还没有贴壁.
好郁闷。
