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标题:[求助]大家来看看我没有成功的DNA-LADDER

qumm1985[使用道具]
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发表于 2012-8-24 12:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]大家来看看我没有成功的DNA-LADDER


各位战友,大家好!

前几天做了DNA-LADDER,但是没有成功图比较难看,也没有除RNA,请大家先委曲将就一下,帮忙分析一下失败的原因或是指出一些成功的要点.并且请告知箭头所指的三个位置条带是什么原因形成的,多谢大家了!
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dragonkilly[使用道具]
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发表于 2012-8-24 12:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

从你的MARKER来判断，好象三条都是凋亡条带，我看结果还可以，要是提DNA的过程再完善一下，还会更好的。
顺便问一下，你是用细胞提的吗，细胞量是多少呀，是在凋亡率为多少的情况下提的。
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hyuu[使用道具]
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发表于 2012-8-24 12:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问，可以做DNA-LADDER吗？
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qumm1985[使用道具]
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发表于 2012-8-24 12:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
但是我感觉不是太象凋亡的图片啊!能不能讲一下理由呢?我用的是六孔板,各取一个孔的细胞 .
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woshituzhu[使用道具]
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发表于 2012-8-24 12:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做这个做了很久，我觉得你的好像不象ladder，可能能够看的出来有凋亡现象，但是这个绝对不是ladder，可能是你凋亡的细胞数量不是很够吧！你化箭头的这些地方出现的一定不是的，这点我可以肯定，你应该也看多很多的ladder的图片，起码有点象云梯状的吧，但是你的完全不是的，所以很抱歉，你可能要再做了！建议先做个hoechst染色，用荧光显微镜看看，这个很快，估计一两天就可以搞定，你就可以知道你细胞凋亡的大致情况了，大致看看数量再做，不是说有凋亡现象就一定能够出现ladder的，以为还有一个凋亡细胞数量的关系，以及其和坏死细胞的一个比例关系，那么当然是凋亡的细胞越多做的ladder就越好看了，要做出一张漂亮的ladder其实不是那么容易的。不过相信你可以的！加油，呵呵！
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qumm1985[使用道具]
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发表于 2012-8-24 12:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢楼上的指点与鼓励!

我还有一个疑问,就是关于原来一个叫CHUJUN的战友发的做DNA-LADDER 的帖子.他是这样写的:

4)加10µl蛋白酶K(20mg/ml，Ambion)，轻弹管尖混匀，50℃孵育至少90min，也可过夜。
储军注: ①在加蛋白酶K之前,轻轻将EP甩几下,使得贴在管壁和管盖上的水滴流至管底
②我采用55℃水浴,时间曾用过3h,4h,6h,过夜,效果差不多,根据您自己的个人时间决定,比如你
现在需要陪MM看碟了,就让它过夜吧,没关系的了!
③加入蛋白酶K后，溶液立即出现絮状白色物，蛋白酶K是冷的缘故，加到37℃的裂解液自然
会出现絮状物，再涌动涌动（同2））,然后再放入55℃一段时间就消失了，不是什么怪现象
④将封口膜将EP管封好,以免EP管中的液体蒸发
⑤做完后, 轻轻将EP甩几下,使得贴在管壁和管盖上的水滴流至管底,这时可以进行电泳或在-20
℃保存以后跑电泳
5)加5µl 6×DNA加样缓冲液(30％甘油，0．25％溴酚蓝)，在含0.5µg/ml溴化乙锭TAE的1％-1.5％琼脂糖凝胶干孔中加DNA样品

我的问题是:他没有用抽提的步骤吗?还是忘记写了?请大家指教!
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dotaaa[使用道具]
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发表于 2012-8-24 12:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的也是CHUJUN的方法，可能是细胞太多（10的六次方），最后形成很粘稠的东西，加样都困难，而且我发觉不能电泳太久，昨天电泳两小时还有东西，三个多小时后，连MARKER都不全了，有人说是分解了，请大家看看我的图中有凋亡的 带么？
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发表于 2012-8-24 12:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的问题是:他没有用抽提的步骤吗?还是忘记写了?请大家指教!

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chujun的方法应该没有太大的问题，不抽提还是可以跑电泳的呀，残留些蛋白对跑LADDER影响不大的。不过我还是建议你用分子克隆的方法或者用试剂盒来抽提一下。正如sygp_0 所说，chujun的方法中，加样非常的困难，粘稠的很，根本无法从离心管里吸出来。
徐家小宝儿，你的图我看了，应该不是凋亡的，更接近细胞坏死的图.hypesnow说的很好，你可以试试。

顺便说下
你的图很奇怪，感觉marker都没有跑开，是不是电压有问题。我以前按chujun的方法做时，没有这种现象啊。
还有，你的图也不象是凋亡的。
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qumm1985[使用道具]
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发表于 2012-8-24 12:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
chujun的方法应该没有太大的问题，不抽提还是可以跑电泳的呀，残留些蛋白对跑LADDER影响不大的。不过我还是建议你用分子克隆的方法或者用试剂盒来抽提一下。正如sygp_0 所说，chujun的方法中，加样非常的困难，粘稠的很，根本无法从离心管里吸出来。
徐家小宝儿，你的图我看了，应该不是凋亡的，更接近细胞坏死的图.hypesnow说的很好，你可以试试。

顺便说下
你的图很奇怪，感觉marker都没有跑开，是不是电压有问题。我以前按chujun的方法做时，没有这种现象啊。
还有，你的图也不象是凋亡的。

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多谢你的指点,看来还是抽提一下比较可取,因为我的不但粘稠,而且我用的蛋白酶K缓冲液中加了SDS,会起泡,估计加样时会跑掉的.
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star#room[使用道具]
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发表于 2012-8-24 12:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也觉得很奇怪，但我是按60V跑的，一个多小时，有人用试剂盒提的DNA说小片段难提出来，只有大片段
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