细胞世界 » 讨论区 » 经验共享 » [求助]PI的配置。急

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:[求助]PI的配置。急

minran_1980[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 75816
精华 1
积分 339
帖子 293
信誉分 102
可用分 2344
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-28
状态 离线
1

发表于 2012-8-25 13:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]PI的配置。急


我要测细胞的膜通透性，70%酒精固定PI标记后上流式检测，我不知道PI的配方，好像有triton-x100，RNA酶，不知道具体的都有什么，以及各自的剂量浓度。请知道的帮忙，急需，谢谢！
顶部
eric930[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79368
精华 0
积分 722
帖子 1061
信誉分 101
可用分 6148
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-10
状态 离线
2

发表于 2012-8-25 13:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
5mg PI +0.1ml Triton X-100 +3.7mg EDTA +10ml PBS,4度避光保存。用时稀释10倍。
也有的直接用PBS配,浓度是1mg/ml.
RNA酶在PI染色之前加入,作用半小时.
顶部
minran_1980[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 75816
精华 1
积分 339
帖子 293
信誉分 102
可用分 2344
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-28
状态 离线
3

发表于 2012-8-25 13:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还有就是要检测时,应该加多少细胞悬液,多少PI?是不是0.5ml细胞悬液,
PI是300μl还是1ml呢
顶部
eric930[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79368
精华 0
积分 722
帖子 1061
信誉分 101
可用分 6148
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-10
状态 离线
4

发表于 2012-8-25 13:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我当时做的:
细胞重悬用0.2ml的冷PBS
细胞悬液中加入0.6 ml碘化丙啶(PI)染液
顶部
minran_1980[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 75816
精华 1
积分 339
帖子 293
信誉分 102
可用分 2344
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-28
状态 离线
5

发表于 2012-8-25 13:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢.我现在有作凋亡的试剂盒,双染的,PI的浓度是50μg/ml,可不可以用?

我在太原,PI没有现货,国庆后就想用,现在只有2ml了,不知道少一点行不行.
顶部
minran_1980[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 75816
精华 1
积分 339
帖子 293
信誉分 102
可用分 2344
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-28
状态 离线
6

发表于 2012-8-25 13:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

还有问题：
RNA酶用多大浓度合适？每次加多少？它的作用是什么呢？
顶部
greenbee[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79370
精华 0
积分 710
帖子 1119
信誉分 100
可用分 6368
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-12-10
状态 离线
7

发表于 2012-8-25 13:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
战友，你如果要测细胞膜的通透性，不能固定细胞，染液选择有错误。

PI染液平时用得很多，看到你的问题我又思考了下，希望能用更理性的语言进行表述：

所有的PI染色几乎都是利用它的两种特性：一是能够与双链DNA/RNA螺旋的大沟部位结合，二是不能通过功能正常的完整细胞膜。基于以上特性，目前主要有两大方面的应用，配方也不同：

（1）一方面的应用是检测膜通透性，由于PI不能进入完整的活细胞膜，因此一般认为PI染色阳性的细胞是死细胞。你的Annexin V/PI凋亡检测试剂盒中就是这种染液，它的作用是鉴定死细胞，从而与凋亡细胞区分开来。它的配制就是将PI溶于PBS，终浓度较低，一般2.5ug/mL。

（2）另一方面的应用是检测细胞周期，由于晚期凋亡细胞DNA断裂形成亚二倍体峰，因此可同时检测凋亡。检测细胞周期时，为了保证所有的细胞都能染上PI，因此要将细胞用乙醇固定，并加入Triton X-100 ，以增加膜的通透性；同时由于DNA使细胞的粘附性增大，加入EDTA以降低细胞粘附性；为了消除RNA的干扰，要加RNAase。由于要鉴定DNA含量，因此PI染料必须过饱和，所以PI终浓度很高，一般50ug/mL。

我不知道你的具体实验设计，如果鉴定活、死细胞比例就用PI染色的阳性百分率做指标；如果你的细胞群膜通透性有不同程度的改变，那么可以用PI染色的阳性百分率和平均荧光强度2个指标进行比较。

希望对你有用，Good luck!
顶部