[求助]MTT结果和流式结果矛盾为什么？！

细胞世界 » 讨论区 » 经验共享 » [求助]MTT结果和流式结果矛盾为什么？！

13 1/2 1 2 ››

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:[求助]MTT结果和流式结果矛盾为什么？！

分子式[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76128
精华 0
积分 242
帖子 223
信誉分 100
可用分 1876
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态离线

发表于 2012-8-25 15:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我最近作细胞毒理试验，发现了一个很奇怪的问题：我先是做了药物不同剂量组对细胞活性的影响即用MTT测细胞活力和半死抑制浓度IC50 ，从而得到了一条药物对细胞活力抑制的抑制率曲线，并得到了半死抑制浓度，并为确保实验数据的准确性重复了多次，数据自以为应该是可靠的；然后我又用流式做了检测DNA凋亡的试验，发现用MTT所得到的半死抑制浓度的剂量去做细胞DNA凋亡，发现并没有亚二倍体峰出现，没发现有凋亡峰，我又加大了药物浓度，加入根据MTT数据足以让细胞全部致死的浓度，我想这次肯定会有凋亡了，但是发现和阴性对照相比仍然几乎没有凋亡，可是我在光镜下观察贴壁的细胞都已经漂了起来，细胞表面肿胀，活力明显地受到了抑制。我的问题是 1、如果细胞因为药物而致死是不是一定有DNA的凋亡？2、假如不一定通过影响DNA而直接坏死的话，那么在做流式检测DNA凋亡的时候，对于坏死的细胞是不是一定能检测到凋亡峰。现在我很迷茫也非常的着急，到底问题出在哪儿？请有经验的高手指点，提些建议，谢谢！（注：我检测DNA凋亡就是用传统的PI染色的方法）

yapuyapu[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 76072
精华 3
积分 574
帖子 695
信誉分 106
可用分 4338
专家分 30
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态离线

发表于 2012-8-25 15:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

PI检测是通过对DNA的含量的检测而对细胞周期及凋亡进行分析的。PI检测的是晚期凋亡，我们说的凋亡峰又称为亚二倍体峰，因为凋亡晚期细胞膜的通透性增加，DNA会丢失，所以细胞内DNA含量要少于正常情况下的二倍体DNA，所以就出现了亚二倍体峰。但细胞膜通透性改变出现在凋亡的晚期，如果细胞处在凋亡早期，DNA没有丢失，PI染色就检测不出来，或者DNA丢失很少时，软件分析很难将二倍体DNA与亚二倍体DNA区分开，也检测不出凋亡。
PI检测凋亡并不敏感，它的好处是可以观察周期，但结果也不是特别可靠。
annexiV（磷脂酰外翻检测）可以检测早期凋亡，并可以将早期凋亡与晚期凋亡区别开，比较敏感。
药物对细胞的毒性作用，大部分是通过凋亡途径，但也有直接坏死的。细胞发生凋亡形态就会发生改变细胞变圆，贴壁性差，但要到晚期才会有大量DNA丢失，才会出现凋亡峰。凋亡需要一个过程，你可以延长药物的作用时间，或者换一种检测方法。

one[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 73393
精华 0
积分 697
帖子 1114
信誉分 100
可用分 6353
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-22
状态离线

发表于 2012-8-25 15:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

同意楼上的。两种检测手段检测两种指标，结果不一致当然很正常！

分子式[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76128
精华 0
积分 242
帖子 223
信誉分 100
可用分 1876
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态离线

发表于 2012-8-25 15:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我还要说清楚地一点的是：我是用了做MTT时足以使细胞致死的相同的药物浓度和作用时间来做流式DNA的检测，在MTT的结果看来细胞都已经死了，难道才仅仅是早期凋亡？如果是直接坏死难道就检测不到明显的凋亡峰吗？希望能得到进一步的指点，谢谢！

分子式[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76128
精华 0
积分 242
帖子 223
信誉分 100
可用分 1876
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态离线

发表于 2012-8-25 15:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如果我加的药物不是通过凋亡途径来导致细胞坏死，那从现在流式检测DNA的结果来看已经致死的细胞依然能看到较规则的二倍体峰和四倍体峰，这是否符合常规？这样的结果正常吗？谢谢！急！

langlang[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 77033
精华 0
积分 668
帖子 976
信誉分 100
可用分 5741
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-12
状态离线

发表于 2012-8-25 15:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如果药物的作用是把细胞杀死，怎么来进行深入研究呢，有哪些方法。

分子式[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76128
精华 0
积分 242
帖子 223
信誉分 100
可用分 1876
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态离线

发表于 2012-8-25 15:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请高手指点,我现在要写文章对这样的实验结果不知道该如何分析和讨论,非常地着急!我现在就只有一个问题想请教那些用流式测细胞周期经验丰富的同志: 如果该细胞不经过凋亡途径直接坏死了,那么在检测细胞DNA的时候有没有可能出现二倍体峰和四倍体峰还较规则的情况,当然几乎没有凋亡峰出现。会不会有这种情况。谢谢了！请高手务必出手指点不吝赐教啊！万分感激！非常着急！

分子式[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76128
精华 0
积分 242
帖子 223
信誉分 100
可用分 1876
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态离线

发表于 2012-8-25 15:11 资料个人空间短消息加为好友

小中大

谢谢kent的热心解答！请问：早期坏死的细胞会是一种什么情况，会不会是核膜不破坏，DNA不断裂的这种情况？有没有这种可能？谢谢！

baidukk[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 77444
精华 0
积分 803
帖子 1226
信誉分 100
可用分 7048
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态离线

发表于 2012-8-25 15:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

用比IC50小的浓度试试

newway[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 76575
精华 0
积分 505
帖子 689
信誉分 100
可用分 4253
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-7
状态离线

发表于 2012-8-25 15:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我将也要做这样的实验，我想请教一下，通过MTT实验时，怎么才算是药物作用的最佳浓度？

13 1/2 1 2 ››