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标题:[讨论帖]原代肝细胞培养的经验与疑难解析

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发表于 2012-8-25 17:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[讨论帖]原代肝细胞培养的经验与疑难解析


做了一段时间的大鼠肝细胞原代培养,发现试验中存在着n多困难与不稳定因素,如两步法灌流分离肝细胞时所得细胞的低活力问题,培养过程中贴壁,生长,增殖慢的问题等,当然也有不少的经验,希望有问题或这方面经验的同仁来此交流,大家共同进步
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moonlight45[使用道具]
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发表于 2012-8-25 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我最近也在做大鼠肝细胞原代培养，总结了一些经验，和大家分享：
1.为保证整个实验过程中灌流液的温度都在37℃，可将水浴温度设的稍高一些，如39℃，防止液体流经灌流管的过程中温度降低，到达肝脏时不足37℃。
2.肝细胞对缺氧极为敏感，因此所有灌流液和细胞洗涤液都需用氧饱和，有助于提高细胞存活率。
3.消化不足和消化过度都对细胞的活力有影响。灌酶之前用无钙灌流液将血液冲洗干净是消化充分的前提。合适的门静脉插管深度和灌流速度是这一步的关键，需要实验摸索。判断消化是否充分的方法：用眼科镊柄端侧面轻压肝大叶正面，压痕消失较慢，且肝组织模糊化。
4.可在细胞洗涤液中加0.005％DNase I，去除死细胞释放的DNA，防止细胞成团。
5.在培养瓶或培养板上铺一层鼠尾胶或I型胶原等物质可促进细胞贴壁。
6.在培养基中加入一些营养因子，如胰岛素、地塞米松，可促进细胞生长。
不足之处希望大家指出！
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eric930[使用道具]
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发表于 2012-8-25 17:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

那请问如果没有氧饱和的设备怎么办?还有,悬浮细胞用的是什么缓冲液啊?我用Hanks,怎么分离的细胞大多数涨破,我怀疑是不是缓冲液渗透压太低
请大家继续支持啊
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发表于 2012-8-25 17:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我悬浮细胞用的缓冲液配方如下：
NaCl 8.3g/L
KCl 0.5g/L
CaCl2·2H2O 0.18g/L
Hepes 2.4g/L
1mol/L NaOH 5.5ml/L
pH 7.4, 4℃保存，临用时加入0.005％DNase I。
离心一次洗细胞后，可用无血清DMEM再离心两次。
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发表于 2012-8-25 18:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不知道镁离子(MgSO4.7H2O)对细胞会不会有影响?
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发表于 2012-8-25 18:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，我想请教几个问题：
1）铺板用的胶原是怎么配的呀。我买好了I型胶原不知该用什么配，怎么样除菌？
2）怎么样氧饱和呀？
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发表于 2012-8-25 18:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

灌流液中不用加0.005％DNase I吧？
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发表于 2012-8-25 18:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

以下是我以前制备大鼠尾胶原的方法。
我用的是24孔板培养，经过铺尾胶原的板和不铺尾胶原板的对照，发现贴壁情况差别不大，虽然尾胶原的制备方法比较简单，但操作繁琐，尤其是尾胶原无法使用滤过和高压等方法灭菌，所以操作过程要严格无菌，一旦污染将导致细胞污染，很难控制，后来就不曾再做尾胶原了。如果觉得你的无菌条件很好的话不妨可以尝试一下。
制备方法：
1、  取大鼠尾巴，洗静，75%酒精浸泡5分钟。
2、  手持尾巴，用止血钳夹注鼠尾巴的尖端，折断尾骨后拉出尾腱。
3、  将尾腱剪断置于平皿中，生理盐水浸泡。
4、  不断重复步骤2、3，直到尾腱量足。
5、  将尾腱称重（0.5-1.0g）。
6、  将尾腱至于平皿或小青霉素瓶内剪碎，转移至三角烧瓶中。
7、  按每克尾腱50ml的比例加入0.1%醋酸溶液。
8、  摇晃，使尾腱分散于醋酸溶液中，4。C放置一星期。
9、  离心，4000转/分，10-15分钟。
10、  吸取上清，分装置小瓶，4。C保存。
制备过程虚无菌操作。
使用方法：
1用吸管将胶原均匀涂于无菌的培养瓶生长面内壁。胶原层不易涂的太厚，以不留液滴为准。
2 瓶口塞以消毒的棉花塞，至于消毒的饭盒内，放在37。C或室温48小时后，干燥后盐水洗涤，既可用。
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toy[使用道具]
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 小中大

哦对了。抽取尾胶原的时候一定要从细端，也就是尾间部抽取，从尾根部端一抽就断了，抽不出来的。
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