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标题:[求助] DMEM培养基的配制

ququer787[使用道具]
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发表于 2012-8-27 15:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助] DMEM培养基的配制


开始养细胞了，但是怎么样配制DMEM培养基还没搞清楚。是不是先把一小包培养基溶于1L无菌水中，然后过滤分装，4度保存。用的时候再加入血清，去9分的培养基和1分的血清，那么NaHCO3还有双抗什么时间加呢？是不是过滤 分装之前就加入培养基中。
谢谢各位啦。
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whitesheep[使用道具]
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发表于 2012-8-27 15:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
NaHCO3还有双抗是在过滤前加的，过滤分装后放入-20度保存。使用前加入10%血清即可
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dotaaa[使用道具]
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发表于 2012-8-27 15:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

NaHCO3在过滤之前加，双抗可以在过滤之后加，也可以不加，血清最好另外过滤，可以先加好或者用之前加入，看细胞而定，不同细胞需要的血清浓度不同，还有，冻存细胞需要的培养液血清含量高一些，一般是20%-30%。另外，培养液和血清过滤分装后，除了正在用的一瓶，其它存放在-20度，否则一些成分，如谷氨酰胺容易降解。
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dotaaa[使用道具]
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发表于 2012-8-27 15:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

配制时可以先用终体积三分之二的水溶解，包装袋也要清洗一下。再加入2g的碳酸氢钠完全溶解，后加入双抗，定容至终体积。过滤后放入－20度保存。用时加血清。
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remenb[使用道具]
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发表于 2012-8-27 15:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

以上建议固然不错，可是未免有些不便。本人的经验，一般血清根本不用过滤，双抗也不需要过滤，这两者在用前加入即可（如果确需双抗的话），除非培养基用量极少，否则没有必要在－20度保存，两周内能用完的培养基在4度存放没有任何问题。另外，我不同意冻存细胞血清含量要高的说法，没有根据。去看看ATCC中细胞株冻存的说明，好像极少要多用血清的，一般10%DMSO+90%加有血清的培养基为最常用的冻存液配方。一般的细胞这样冻存存活率极高。（当然冻存程序也很重要）
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yychen[使用道具]
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发表于 2012-8-27 15:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也认为血清没必要过滤，不过我觉得双抗还是应该过滤一下，毕竟也不是很麻烦的。另外关于细胞冻存时血清加入量的问题，其实最重要的是冻存程序，如离心速度不要过大等，还有就是DMSO的量不能超过10％，这点很重要的。
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tianmei001[使用道具]
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发表于 2012-8-27 15:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我养细胞已经有5、6年了，用纯血清+10%DMSO或者10%血清+10%DMSO+培养液都使用过，效果都可以。不过冻存过程确实很重要。
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黄花菜[使用道具]
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发表于 2012-8-27 15:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

除了直接加入DMEM粉末外,还应按照说明书添加适量的NaHCO3,大约是2g吧,此时的pH可能远远大于你所需要的pH,再添加适量HEPES,大约2.38g,pH满意后,根据需要添加双抗,过滤,分装.如果近期用量不是很多,就把多余的放-20度保存,需要时添加血清,此时的血清是不需要灭菌的,因为合格的血清已经达到无菌条件,摇匀即可
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toy[使用道具]
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发表于 2012-8-27 16:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1袋干粉+3.5克Herps+1克NaHCO3,基本上就可以了，不需要加其它的东西了。
其中NaHCO3的量可以有一点变化，不过最好不要超过2克，否则，培养基会偏碱，不利于细胞生长的。
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发表于 2012-8-27 16:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一般袋装的DMEM培养基溶解后都要偏酸，所以要加NaHCO3约2g，但不要一次加入，而应该边测ph值边加，本着宁酸勿碱的原则，而且配好的DMEM放置一段时间后还可能变碱。血清一般用时再加，因为提前加容易加重细菌污染。
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