小中大六孔板转染,其实不需要太多质粒,我用10微升(1-2微克)质粒转一个孔。
细胞要达到70-80%丰度(占孔的面积比)。
我用的是invitrogen的LIP2000,程序如下:
转染前的准备:
(1)向1.5ml Eppendorf管中加入500μl DMEM,再加入6μl脂质体LipofectamineTM2000,混合均匀,记做A液;
(2)向1.5ml Eppendorf管中加入500μl DMEM,再加入1~2μg线性化的表达载体,混合均匀,记做B液;
(3)A液与B液在室温下放置5min,集中到一个Eppendorf管中,记做C液,室温静置20min。
将培养的CHO细胞分散至6孔板,待其生长至70%~80%汇合时,吸弃培养基,用新鲜的DMEM洗涤两遍,加入新鲜的DMEM 500μl。将C液加到每个孔中,轻轻混匀,置于37℃的CO2培养箱中,3h后,每半小时观察一次细胞,待细胞形状由梭形变为稍圆形时,吸弃孔中的液体,换上DMEM基础培养基,继续培养。
多质粒共转,其实一样,就是转后要筛选。关键是“转染3h后,每半小时观察一次细胞,待细胞形状由梭形变为稍圆形时,吸弃孔中的液体,换上DMEM基础培养基,继续培养。”