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标题:[求助]关于转染的几个问题求教!

hyuu[使用道具]
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[求助]关于转染的几个问题求教!


我要做的是pcdna3。1质粒转染人293t细胞,还没有做,还有几个问题,所以迟迟不敢下手去做。
1 在六孔板上转染时所要确定的dna的浓度多大最好啊?
2 转染时细胞所需要达到的浓度是多大最好?
3 具体转染的步骤还不大清楚,我已经购买了invitrogen的磷酸钙转染试剂盒,是否可以就按着产品的建议步骤去做呢?
4 我还要做4质粒共转染细胞,请问有哪些要注意的地方吗?
各位先辈一定做了很多的这方面的研究,能传授我点这方面的经验吧,谢谢!
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sunnyB[使用道具]
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六孔板转染,其实不需要太多质粒,我用10微升(1-2微克)质粒转一个孔。
细胞要达到70-80%丰度(占孔的面积比)。
我用的是invitrogen的LIP2000,程序如下:
转染前的准备:
(1)向1.5ml Eppendorf管中加入500μl DMEM,再加入6μl脂质体LipofectamineTM2000,混合均匀,记做A液;
(2)向1.5ml Eppendorf管中加入500μl DMEM,再加入1~2μg线性化的表达载体,混合均匀,记做B液;
(3)A液与B液在室温下放置5min,集中到一个Eppendorf管中,记做C液,室温静置20min。
将培养的CHO细胞分散至6孔板,待其生长至70%~80%汇合时,吸弃培养基,用新鲜的DMEM洗涤两遍,加入新鲜的DMEM 500μl。将C液加到每个孔中,轻轻混匀,置于37℃的CO2培养箱中,3h后,每半小时观察一次细胞,待细胞形状由梭形变为稍圆形时,吸弃孔中的液体,换上DMEM基础培养基,继续培养。

多质粒共转,其实一样,就是转后要筛选。关键是“转染3h后,每半小时观察一次细胞,待细胞形状由梭形变为稍圆形时,吸弃孔中的液体,换上DMEM基础培养基,继续培养。”
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66小飞侠[使用道具]
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我用的也是invitrogen的LIP2000,但和楼上的有些不同,写出来供你参考:
转染的细胞要达到90%-95%长满
转染的步骤:
1 在1.5ml Eppendorf管中加入250ul的DMEM-1640,主要是不要有血清和抗生素,再加4ul的载体,用枪轻轻混匀,从液面下吸上在液面上打出,一定要轻,记做A液。
2 在1.5ml Eppendorf管中加入250ul的DMEM-1640,在加10ul的lip,如上轻轻混匀,记做B液。
3 A、B液室温放置5min。
4 把两者轻轻混匀,放置20min,记作C液。从开始到混合时间不要超过30min
5 用DMEM-1640冲洗细胞2-3次,动作要轻柔,然后加入150ulDMEM-1640。
6 将C液加入孔内,轻轻混匀,体积为200ml。置于37℃的CO2培养箱中24-48h。
7 转染6h后可以更换培养液,加入有血清的培养液。
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caihong[使用道具]
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我也是在做转染,看了你们的贴子觉得很帮助。
但是现在有一个疑问:试剂公司的人说质粒和脂质体共孵的时候必须使用无血清抗生素的介质,但在转染过程中可以使用含血清和抗生素的完全培养基。请问是这样吗?
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rxcc33[使用道具]
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在发生转染的几小时内用无血清抗生素的介质,然后换成含血清和抗生素的完全培养基。
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HP007[使用道具]
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我感觉直接用加抗加血清的介质稀释转染试剂也能达到预计效果阿——当然有时转染效率没有用无抗无血清的好
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泡泡[使用道具]
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楼主有一个事情要注意:

293T是不能做稳定转染的,因为细胞本身就有G418抗性

除非你的筛选不是基于G418,比如ZEOCINE
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remenb[使用道具]
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293真的有G418抗性?楼上确定吗?
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xue258[使用道具]
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293T细胞本身有G418抗性,不是293细胞.
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hyuu[使用道具]
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非常感谢几位了,你们给我得建议真太宝贵了,谢谢!希望管理员能给他们加分,我还有个疑问:我买到的转染试剂盒是磷酸钙转染得,我不清楚是否能参照上边各位提供的 方法去做呢?我还不大清楚,谢谢!愿各位工作顺利!
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