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标题:[求助]贴壁细胞消化的时间

avi317[使用道具]
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发表于 2012-8-27 17:27 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]贴壁细胞消化的时间


以前一直养悬浮细胞，现在养贴壁细胞，总感觉消化时间老是把握不好，有时候消化过头了，损失很多细胞；有时又消化不充分，导致吹打时候困难，恳请各位大侠给予指点！
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langlang[使用道具]
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发表于 2012-8-27 17:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我以前也出现你的问题，时间长短要看你的胰酶，几秒到几分不等，在显微镜下你的细胞间隙变大，就可以终止消化了
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langlang[使用道具]
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发表于 2012-8-27 17:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

消化时间和细胞类型、消化液的消化能力、细胞的密度等多种因素有关。一般养一种新的细胞要摸索一下消化时间，掌握细胞消化到什么程度恰到好处。新配的消化液消化能力较强，配好后可分装成小管，一次用完，其余冻在－20℃，以保持酶活力。消化液只需铺满瓶底即可，可放入培养箱中，因外在37℃时酶的活力高于常温，有利于缩短消化时间。还有一种方法，就是将胰酶铺满瓶底后，轻摇培养瓶，使胰酶与细胞充分解除，然后倒掉大部分胰酶，利用剩余的少量胰酶再消化一段时间，待细胞间空隙增大，瓶底呈花斑状即可。细胞生长到覆盖70～80％瓶底时消化较好，若细胞密度过大则消化后细胞易成团。
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misswu61[使用道具]
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发表于 2012-8-27 17:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

消化时间不应超过5分钟，否则对细胞损害很大。消化液覆盖细胞，成一薄膜，然后反复倾斜，使消化液冲刷细胞，当细胞收缩，部分细胞脱落时，可用完全培养基马上中和，同时吹打壁上细胞。应该没问题。
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lagua123[使用道具]
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发表于 2012-8-27 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

把胰酶PH调到8.0左右，消化几分钟就好了。我的细胞消化2分钟就可以了。
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owanaka[使用道具]
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发表于 2012-8-27 17:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

5分钟就可以了，胰酶pH 8.0
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avi317[使用道具]
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发表于 2012-8-27 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我知道对于不同细胞，消化时间是不一样的，我想问的是：消化充分可以吹打下来但不至于象泥石流一样大量脱落，也就是说，在肉眼可见瓶底有什么变化的时候就该倒掉消化液。
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zwsyrt[使用道具]
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发表于 2012-8-27 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

首先确保胰酶的活性是正常的,然后控制消化时间,一般1-3分钟比较好.同时在判断细胞缩小出现间隙时就可以终止消化,不要等细胞消化到脱落了,这样消化已经过头了,对细胞的损伤也很大.同时细胞不能密度太大,如果细胞已经长了好几层了,消化时细胞就会象一层半透明的薄纸一样脱落.这时的细胞一般成团状,也不利于细胞的生长.细胞的状态也不会好
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kewanqi2011[使用道具]
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发表于 2012-8-27 17:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

除了trypsin 之外 加入EDTA的濃度也很重要
一般是加入0.25M 100 ul in 100 mL PG with trypsin

消化時間一般是3-5分鐘 置於37C incubactor中
之後馬上用血清中和 以免細胞受損
如果細胞仍貼壁太多 則可再加上pipegun 以流速沖激的力量即可

消化液是用中和的 而非倒掉
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zzzz[使用道具]
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发表于 2012-8-27 17:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

胰酶的活力与消化时间关系密切。我的经验是先把胰酶温度升到37度，胰酶倒入培养瓶后放回培养箱以保持温度。平时胰酶封装成小瓶以避免反复冻融。掌握好温度后，作用时间和胰酶的量就比较好摸索了。一般作用时间以细胞尚未完全脱落，但轻叩瓶底细胞可脱落为最佳。很多人没有注意到温度的重要性，因此我在这里特别强调一下。
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