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标题:[求助]MTT的OD值

mickeylin[使用道具]
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发表于 2012-8-27 17:39 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]MTT的OD值

大家好. 我用MTT检测药物对肾小管细胞的毒性. 接种后培养24小时, 同步24小时,药物作用24小时, 然后按MTT方法在490NM处测OD. 如用10*4接种, 最大OD(正常组)不超过0.3, 如用2*10*4接种, 最大不超过0.51,. 文献说这组要在0.7-1.2才好. 请高手指点.
另外, 2组OD均数差值仅仅0.02, 0.04(2组OD均数分别为0.46, 0.48), 但统计学有意义,. 请问这样能行吗?
谢谢!
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xingyi08[使用道具]
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发表于 2012-8-27 17:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
只要细胞在最终加入MTT时细胞铺板底的70-80％就是最佳的铺板浓度，可以摸索一下，对于你的数值如此差值知晓，有些不可信，需要重复。
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mickeylin[使用道具]
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发表于 2012-8-27 17:40 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢楼上！莫非我10*4浓度过低, 而2*10*4又过高. 如是这样, 加药组应该高, 可是也很低, 请求大家发言. 我重复了很多次, 都这样, 老师说酶标仪没问题, 我该怎么办?
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mickeylin[使用道具]
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发表于 2012-8-27 17:41 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

大家做MTT 时最后加DMSO要不要稀释, 有同学说要加水和TRITON X-100, 2小时后测MTT. 你们都是怎么做的? 多谢了!
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101010[使用道具]
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发表于 2012-8-27 17:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不知道你是如何做的，将具体过程说一下，或许会有主意。
比如我们做肿瘤细胞的过程如下：
1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，每孔180μl，3000-10000个/孔。
2）置37℃、5%CO2温箱培养使细胞贴壁，培养6-24小时。
3）加入待筛样品20μl，继续培养44小时。
4）小心吸去上清，加入80μl新鲜RPMI 1640培养液，再加入20 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。
6）然后吸掉上清，每孔加入150 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值。
7） 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。
8） 计算抑制率＝[(对照-空白)-(给药-空白)]/(对照-空白)X100%.
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mickeylin[使用道具]
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发表于 2012-8-27 17:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢楼上的. 我具体做法如下:

1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，每孔100μl，10*4-2*10*4个细胞/孔。
2）置37℃、5%CO2温箱培养使细胞贴壁，培养24小时。
3）换为无血清培养液,培养24小时
4) 换为含药培养液200μl，继续培养24小时。
4）小心吸去上清，加入100μl新鲜D/F-12培养液，再加入11 ul MTT溶液（5 mg/ml，），继续培养4 h。
6）然后吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值。
7） 同时设置调零孔(二甲基亚砜），每组设定6复孔。

楼上的高手,多谢你. 你们MTT加那么大的量吗?
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mickeylin[使用道具]
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发表于 2012-8-27 17:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
自己顶一下,请大家积极讨论.
DMSO溶解后是紫色还是蓝色?
我的是前者
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yhz1973[使用道具]
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发表于 2012-8-27 17:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

应该是紫色，你的MTT是不是有问题，或者DMSO的问题。
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mickeylin[使用道具]
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发表于 2012-8-27 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的MTT是SIGMA的, DMSO是华美的, DMSO 用于细胞冻存很好的.
加DMSO 之前镜下可见蓝绿色结晶. 加DMSO后立即变紫, 振荡10分后测490nm处OD值.

请大家帮忙,多谢了!
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dragonkilly[使用道具]
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发表于 2012-8-27 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.你的MTT加入之前应该是黄色透明的，如果是蓝色或绿色说明已经染菌。
2.1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，每孔100μl，10*4-2*10*4个细胞/孔。
正常细胞一般倍增时间长的话要大一点细胞数量，5*10的5次方。
3.换为无血清培养液,培养24小时
为什么换无血清培养液？这样对细胞会又损害，而且你可以看一下如果培养基颜色没有什么变化，可以不换培养基，足可以让细胞生长72小时，另外在同等培养条件下培养细胞加入药物组和正常组是没有培养基差异的。
4.换为含药培养液200μl，继续培养24小时。
加入的药物可以用100ul培养基溶解，直接加到孔中。
5.可以不洗上清，这样很容易洗掉细胞，特别是正常的细胞，直接加MTT。
6. 在镜下看是紫色是对的，但是我建议你不要吸出来，直接用SDS列解法做，这样可能会减少你实验中由于操作引起的误差。
7.MTT加20UL既可以。
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