小中大作为有杀伤效应的CTL,是通过分泌Perforin来直接杀伤靶细胞,或分泌IFN等细胞因子来激活其他的免疫途径.但是你要得到特异的CTL的数量,你要把CTL同其他的细胞区别开来..CD3+的细胞是T细胞,而CD8+的细胞是CTL,通过对你获得的细胞进行CD3CD8的标记,你就可以通过流式检测出你的细胞群中间有多少的T细胞,多少的CTL,通过Perforin的标记你就可以知道有多少的CTL具有杀伤功能或者正在执行其功能.这三个荧光标记的抗体你都必须购买,还有一些比如固定剂,通透剂也需要购买,我用的都是BD公司的,你可以取找他们问一下.
拿PBMC来作为一个例子:
1:分离PBMC,取10*6的细胞,用 staining buffer 洗涤两次,100ulstaining buffer重悬,加入CD3-PC5,和CD8-PE.4度标记15MIN,洗涤两次,1500RPM离心5分钟.
2由于Perforin是在细胞里面的,所以你的细胞必须通透,也就是在细胞膜上打孔后,你的抗体才能进去. 通透剂4度通透20分钟.洗涤两次,2500RPM离心5分钟,注意:通透之后细胞变轻,离心速度要加大,还有要用特殊的WASH BUFFER,以免staining buffer 重新关闭孔.
3,加入FITC标记的Perforin,4度标记30分钟,洗涤两次后就可以上流式了.
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您好！想请教几个问题：
1. 为什么使用PBMC，不直接用全血？因为分离PBMC对细胞表面的抗原或者活性都有影响的。
2. 你写的离心速度换算成离心力是多少？
3. 特殊的WASH BUFFER是什么？
4. Perforin4度标记30分钟，我们一般室温30分钟，你的会不会结合不完全？尤其在检测表达量很低的样本时。
