细胞世界 » 讨论区 » 经验共享 » [求助]内皮细胞传代怎么才能传好啊?

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 14  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:[求助]内皮细胞传代怎么才能传好啊?

2541[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75124
精华 0
积分 742
帖子 1144
信誉分 100
可用分 6580
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
1

发表于 2012-8-27 18:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]内皮细胞传代怎么才能传好啊?

我一直在种脐静脉内皮细胞,原代养的还不错,我是种在24孔板上的.可是传代就一直没传成功过,好像数目都没多起来.
我是用0.25%胰酶每孔加100UL消化三分钟,然后吸去胰酶,再加1ml培养液吹打, 然后吸出500ul种于新的一孔,相当于一孔传成两孔,用的培养液内含15%的进口胎牛血清和10ng/ml的EGF.
关键是传了以后感觉数目并没有增多.每次种原代,感觉细胞就前三天长的比较快,第二天个子都很小,第三天就变打了,三天以后再怎么换液都不会长了,都保持原样.
看你们都能传那么多代,我居然连一代都传不了,不知道是哪里出了问题.请各位师兄师姐帮帮忙.
顶部
qhyu[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77304
精华 0
积分 705
帖子 1049
信誉分 100
可用分 6111
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-15
状态 离线
2

发表于 2012-8-27 18:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的内皮细胞是用培养瓶的，希望以下经验对你有所帮助。
1：加胰酶之前用D-HANKS液洗2－3遍，去除遗留的代谢产物和血清。
2：每瓶细胞加1ml胰酶（含EDTA），倒置显微镜观察，见有细胞脱落时立即加10％FBS培养基中止消化。充分吹打细胞脱落后8000离心5分钟。
3:离心后到去液体，再加10％FBS培养基（量可根据传代细胞瓶数灵活掌握）吹打100下以上再分瓶分装。
4：个人感觉10％FBS对脐静脉内皮细胞已经足够（原代需20％），传代后一般2天就可以倍增。
5：细胞变大是老化的现象
顶部
2541[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75124
精华 0
积分 742
帖子 1144
信誉分 100
可用分 6580
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
3

发表于 2012-8-27 18:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
那你传代是原代养到什么程度开始传的?
我一般是种了以后第二天去看细胞体积还小的,第三天就长大成梭形和铺路石状,这应该不是老化的表现吧?
你的胰酶是多少浓度的呢?里面含EDTA是不是你稀释过了?
顶部
caihong[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 73197
精华 1
积分 795
帖子 1206
信誉分 102
可用分 6856
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-20
状态 离线
4

发表于 2012-8-27 18:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

75％以上长满后传的，开始1：2传，一般3－4天就可以传1代，碎石路是表准正常状态。我的胰酶是0.08％＋0.025％EDTA。
顶部
TAT[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 74236
精华 0
积分 507
帖子 694
信誉分 100
可用分 4298
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-8
状态 离线
5

发表于 2012-8-27 18:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请你购进的脐带 购自哪里呢谢谢！
顶部
2541[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75124
精华 0
积分 742
帖子 1144
信誉分 100
可用分 6580
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
6

发表于 2012-8-27 18:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 TAT 于 2012-8-27 18:09 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')

请你购进的脐带 购自哪里呢谢谢！

我的脐带是在产科拿的。
顶部
ending[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76092
精华 0
积分 771
帖子 1242
信誉分 100
可用分 6981
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
7

发表于 2012-8-27 18:15 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

传代的细胞换液的频率应该是怎么样的呢？我种原代的时候基本上是隔一天换一次液，也就是三天换一次，传代细胞是不是需要换液换的频繁一点?
顶部
skytree[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76459
精华 0
积分 372
帖子 444
信誉分 100
可用分 3026
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态 离线
8

发表于 2012-8-27 18:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

内皮细胞很容易消化，我用的是0.05%的胰酶，消化大概一分钟就看到细胞收缩变圆，此时就把胰酶吸出，怕吹打不下来的话可以过半分钟在加加油血清的培养液终止消化，吹打后一传二就行。传代后的细胞可以隔两天换一次液，如果细胞长得超过半满后可以隔一天换一次
顶部
jrwyyplt[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 79380
精华 1
积分 406
帖子 488
信誉分 102
可用分 3193
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-10
状态 离线
9

发表于 2012-8-27 18:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
说离心8000×5，我个人经验是1000×5即可。时间过长，会影响细胞活力。
顶部
2541[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75124
精华 0
积分 742
帖子 1144
信誉分 100
可用分 6580
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
10

发表于 2012-8-27 18:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我1000×5min离心后，重悬，再计数，发现计数下来的细胞还不如原来的多，也就说要是按照计数的数量来种的话，种的还不如原来的多。这样好像就没有传代的意义了？不过计数的时候显微镜下看细胞的个头都很大，比原代计数要大的多，难道是一堆而不是一个？那这样的话岂不是计数也不准确了。不知道各位是怎么处理的？
还有加药物干预前，要先加无血清培养基培养24h，可是我往往前面都长的很好，每到这一步加了无血清以后，就会死一大批，这样的话，前面培养的都前功尽弃，心疼死了。有人说无血清其实不能完全无血清，可以加5％以下的血清，我也照办了，加了5％的血清，可是还是死一批，不知道原因何在，各位有碰到这种情况的吗，该怎么处理？我原代培养的时候是加15％的进口胎牛血清。
顶部
 14  1/2 12››