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标题:[求助]有做逆转录病毒感染靶细胞的战友吗

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发表于 2012-8-28 12:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]有做逆转录病毒感染靶细胞的战友吗


我做逆转录病毒感染靶细胞的实验，转染成功见荧光，感染nih3一直未见荧光，有战友吗？我的问题在哪？
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baidukk[使用道具]
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发表于 2012-8-28 12:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你可以作逆病毒克隆的鉴定及筛选：
a.光镜观察：将用逆转录病毒转染的细胞置于倒置相差显微镜下观察，看看是否出现CPE反应；
b.PCR鉴定：取25%蛋白酶K 1ul，加入5ul病毒液中，55℃反应1h后，水浴煮沸5min，取上述产物1ul为模板，引物同前，建立25ul的PCR反应体系，以前述反应条件，在自动PCR仪中进行扩增反应，取适量反应产物行1%琼脂糖凝胶电泳观察。有没有荧光基因的表达！
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发表于 2012-8-28 12:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

见到您的帖子很感动，您说的这两种方法我没试过。现在使用收集的病毒上清感染NIH3,一直未见荧光，您用没用过这个方法？文献上都说用NIH3测滴度我不知问题出在哪。再一我不知CPE是啥，请指教多谢
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发表于 2012-8-28 12:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

细胞病变效应(CYTOPATHIC effect,cpe)实验
病毒感染的细胞由正常的形态逐渐成球形并对光的折射增强,许多病变的细胞聚在一起呈葡萄状,由贴壁状态逐渐脱落的过程...还有蛮有用的是MOI(被感染细胞的表型变化与病毒接触的时间以及病毒细胞比率有关称为感染系数).
CPE可以直观地显示靶细胞对病毒的敏感与否并确定病毒所需剂量,又可以验证病毒的特意性
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发表于 2012-8-28 12:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

例如:我养的是肝癌细胞株-hepg2,在加了病毒(每个细胞500个)以后.24H-48H细胞变大,变圆,但是还在贴壁.72H后细胞就呈葡萄状聚在一起,飘起.
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发表于 2012-8-28 12:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您所说的细胞形态改变，在普通显微镜下我也见过，我养得nih3正常成纤维状，感染2天后见有的细胞变圆，折光增加。cpe在普通显微镜下能见吗？按理2天后能见荧光，为啥我的没见荧光？您的病毒(每个细胞500个)？离心处理的还是用滤膜滤过的？请指教
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发表于 2012-8-28 13:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

CPE是在普通显微镜（10×10）下就可以看见的。你说的荧光，应该是荧光基因或是荧光染料之类的吧。我不知道你做的是哪种。我只做过AD.GFP，荧光很强的。保证试剂的浓度和增加细胞膜的通透性再试一次吧。如果是用病毒转染的话，先用浓度低的培养基加病毒后抚育90分钟，再用高一点浓度配养基，保证病毒能充分与细胞接触。
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发表于 2012-8-28 13:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

病毒是用离心处理的。病毒的浓度是用空斑试验大致估计的，可能马上用氯化铯测
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发表于 2012-8-28 13:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我说的荧光使GFP,转染时有，感染后48小时不见，继续G418全杀死。有的细胞变圆，折光增加。您说的病毒离心是指逆转录病毒吗？它不是以出芽的方式出细胞吗？我有几次感染直接加的病毒液和POLYBRENE,未加培养基细胞长得不错，还是没感染上。您有QQ或POPO吗？可不可以直接请教，这样太慢
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 小中大
murine leukemia virus does not cause CPE.
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