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标题:[求助]骨髓细胞的转染后的筛选,是否必须依赖细胞因子?

wu11998866[使用道具]
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[求助]骨髓细胞的转染后的筛选,是否必须依赖细胞因子?


我在做骨髓细胞的转染,想建立肿瘤细胞。知道以前有这样的报导,收集的骨髓细胞,转染癌基因后被转化成肿瘤细胞。可以不依赖任何细胞因子而快速增殖。

我的做法也是收集骨髓细胞(全骨髓细胞,未经5-FU处理,只去除红细胞),转染癌基因。在转染的前2天,IMDM培养基中含10% WEHI-3B上清。

我准备在第三天后准将去除WEHI-3B条件培养基,改为普通培养基。如果有细胞克隆增殖的话,再加G418筛选。

我有一个问题不确定:
1、是不是移除细胞因子后,骨髓中未转化的细胞会死亡(去除培养中的贴壁细胞、基质细胞)。是不是可以把这种方法做为筛选方法之一。是否可以取代G418筛选。

抱歉,我在别的版发帖,没有回应,我在这里再发一次。请战友帮助。
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wu11998866[使用道具]
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那我就再多解释一下:骨髓细胞不是单一的细胞群,会有原始的干细胞、祖细胞、成熟细胞及基质细胞。做干细胞或祖细胞培养时,一定要加细胞因子的。所以我想如果去除细胞因子的话,这些骨髓细胞会死的,而且我的记忆中也是这些细胞的生长依赖于细胞因子。
所以我想,转染癌基因的细胞恶性话,就可以不依赖细胞因子而生长,所以我想用G418筛选和去除细胞因子是不是有相同的作用。
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yysr238[使用道具]
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那会否发生分化呢?
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wu11998866[使用道具]
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会的。
但分化不能增殖,细胞会越来越少的,我这样想。
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wu11998866[使用道具]
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结果Update一下。

从上周2转染到今天已经7天了。我在第三天移除了细胞因子后,有很多的细胞死亡。我在第5天开始加G418筛选(恢复了细胞因子)。目前看,情况还不错,很多的死细胞,另外,有部分的细胞开始增殖、分裂,培养瓶中可以看到正在分裂的细胞,也开始新出现4-5个细胞的细胞群。
现在很多的死细胞没有办法移除。
我想先维持目前的状态,继续相同浓度的G418筛选,等细胞再多起来后,考虑用不含细胞因子的G418再筛选试试。看情况做克隆化。
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移除死细胞的方法可采用半量换液或小半量换液,补加含有同浓度药物的培养液继续筛选,死细胞太多会影响细胞生长,全量换液细胞也会因为生长环境变化太大而死亡,建议试试
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wu11998866[使用道具]
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今天的细胞继续增长,状态良好,是悬浮细胞,多的有7-8个松散聚集在一起,我估计在过3-4天,细胞的数量就够多了。

我的目的是今后想用这些细胞建肿瘤模型。克隆化应该是必须要做的。
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wu11998866[使用道具]
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今天是转染后的第9天,加G418筛选后的第7天。可以停止G418了吗?想听听大家的意见。

[ 本帖最后由 wu11998866 于 2012-8-28 14:05 编辑 ]
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zranqi_1[使用道具]
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依我转染其他细胞的经验来看,加G418 7天后,可以先停2天,待细胞活力恢复或扩增的细胞数量多了以后,传代,然后再加G418继续培养,防止未转染的细胞卷土重来。
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wu11998866[使用道具]
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依我转染其他细胞的经验来看,加G418 7天后,可以先停2天,待细胞活力恢复或扩增的细胞数量多了以后,传代,然后再加G418继续培养,防止未转染的细胞卷土重来。

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真的是个好注意,我也注意到筛选很多天之后,的确有耐药细胞生长,但似乎在选择压力下,生长状态不好。所以我在2天之前把G418暂时降下来,等细胞先长起来。

只是现在拍照片不方便。
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