[求助]如何处理肺癌细胞(A549)杂质问题

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标题:[求助]如何处理肺癌细胞(A549)杂质问题

+小生怕怕+[使用道具]
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发表于 2012-8-29 14:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

现培养一肺癌细胞(A549),复苏几次了,总是有杂质,生长极其缓慢,虽给予勤洗,换液,总是旧颜不改......老板摧着提蛋白做Western blotting.急得慌!而最近几次细胞还老得流感,细菌滋生,用的东西都做了细菌培养,没菌.操作也没问题,难找原因???在此请教各位给予赐教,静候佳音!

yapuyapu[使用道具]
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发表于 2012-8-29 14:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1.有可能冻存的时候细胞就有问题，所以导致每次复苏细胞都状态不好
2.“用的东西都做了细菌培养,没菌”，这个是客观的，但“操作也没问题,”这个可不敢说，有时候是当局者迷
3.建议，检查一切与细胞直接和间接解除的物品，特别点名水浴箱；可以取一只让别人帮忙复苏养养试试，看看到底是自己的原因还是细胞的原因

阿敏[使用道具]
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发表于 2012-8-29 14:23 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问楼主用的是什么培养基？可能也有一定的关系，我曾经试过用DMEM和1640分别养，觉得用1640要清爽一些，还有人建议用MEM，可以试试

owanaka[使用道具]
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发表于 2012-8-29 14:24 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1640,

911[使用道具]
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发表于 2012-8-29 14:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

用1640。提高血清浓度试一下。我们老师对待复苏后活力不佳的细胞就是这么做的

okhaha[使用道具]
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发表于 2012-8-29 14:25 资料个人空间短消息加为好友

小中大

好的，我试一试，我好像也听有人讲多加点小牛可使细胞状态变好

lixi559[使用道具]
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发表于 2012-8-29 14:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也同意二楼的说法,复苏的细胞和冻存时的细胞状态非常有关,建议你复苏不同时间冻存的看看。另外给你一点我养这个细胞的体会：
1．复苏后1000转离心2～3分钟去处冻存液后，(有人说可以不去冻存液,两种方法我都试过,觉得去掉好些).再用20％血清浓度培养。
2．观察细胞贴壁情况(一般6小时左右就可以啦)细胞有贴壁的,但漂浮的死细胞很多的话,马上换液,继续用20%的血清浓度培养.
3.一般换过液后,细胞的状态会好些,以后就可以用10%甚至更低的血清浓度培养了.(因为长的太快,我本人就用5%)
4.等长到80%融合时考虑传代,如果太长满了,细胞状态也不是太好.冻存时也一样.
5.建议复苏的细胞用一次性培养瓶养,贴壁较好.准备做实验的细胞用复苏后的2~3代最好,传的太久细胞状态也会不好.

leifengta[使用道具]
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发表于 2012-8-29 14:26 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也在养A549，前一段时间也感觉细胞状态不好，胞浆内似乎含颗粒，不太干净，也总是有杂质。最近请教了一位养此细胞的专家，他说这种细胞的培养条件并不严格，1640或DMEM都可以，如果用进口胎牛血清的话，5%就可以长的很好。但此细胞繁殖速度非常快，传代一定要及时，不要完全长满了传，而要在80%就传，否则很容易细胞堆积崩解并逐渐造成细胞的老化。另外，对于刚复苏的细胞，开始由于冻存时对细胞的损伤，必然出现种种细胞状态不良的问题，特别是冻存的细胞本身状态不是非常好的情况下。这时注意观察，及时换液去除杂质，刚复苏的细胞处于不同的细胞周期，开始的生长节律是不一致的，肯定是有的刚繁殖，有的已要凋亡。如果细胞总体生长速度还可以，那么耐心的培养2-3代后，等细胞的生长周期趋于基本一致时状态就稳定了。如果复苏后细胞生长极其缓慢甚至不长，那么只要不是接种密度太低，就要考虑是冻存的问题了。

wsll[使用道具]
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发表于 2012-8-29 14:28 资料个人空间短消息加为好友

小中大

真是经验之谈啦！我觉得很在理，养此种细胞一个多月了，总是很难看到清爽的细胞，看来还是的经常到bbs交流，和大家讨论讨论，向各位取取经，试试好的方法，我想我的细胞应该有望了