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标题:[求助]流式细胞仪检测凋亡细胞效率低？

dotaaa[使用道具]
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发表于 2012-8-29 17:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]流式细胞仪检测凋亡细胞效率低？


我最近试验结果显示，DNA ladder，Hoechst 33342/PI,Anexin v/PI 染色都显示明显的凋亡，而使用流式细胞仪（Anexin V/PI）双染定量检测凋亡结果却显示凋亡比例非常低，不到1%，我很郁闷，不知道是哪里出了问题？
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发表于 2012-8-29 17:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我最近试验结果显示，DNA ladder，Hoechst 33342/PI,Anexin v/PI 染色都显示明显的凋亡，而使用流式细胞仪（Anexin V/PI）双染定量检测凋亡结果却显示凋亡比例非常低，不到1%，我很郁闷，不知道是哪里出了问题？
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发表于 2012-8-29 17:26 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我没做过这个实验，但听师兄说过。他以前做实验的时候在染色后上机前是否洗，洗几次，都是实验的关键，可以尝试下洗的次数，然后上机看凋亡峰的变化。
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发表于 2012-8-29 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

慢慢分析：
如果您肯定ladder的结果是大量凋亡，那么fcm肯定也测得出。而AV结果不到1％的原因可能是您的染色步骤了。
BD公司的AV染色有两种版本，一个是细胞用冷PBS洗，一个是binding buffer洗。之后是一样的，Annexin V 5ul/pi 5ul 15min RT 避光。然后马上上机。
如果操作也没问题，偷偷怀疑一下上机者的操作^_^！因为我个人做AV较多，它还是相当敏感的，没有凋亡是不是以上原因？
要不，是不是因为离心速度的问题？1000转 5min！ok
还有，每次洗涤时吸取上清时要轻！！
没有了，想到再说。
还有：：：您的问题提得不是很标准，“流式细胞仪检测凋亡需要多少凋亡细胞？改一下？
好运！
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ququer787[使用道具]
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发表于 2012-8-29 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我想问一下，为什么洗涤会有影响？
如果不洗会有什么结果？
谢谢指教！
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发表于 2012-8-29 17:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我最近试验结果显示，... ...Anexin v/PI 染色都显示明显的凋亡，而使用流式细胞仪（Anexin V/PI）双染定量检测凋亡结果却显示凋亡比例非常低，不到1%，

————————————————————————————————————————————————————————————————

你说的前面的Anexin v/PI 染色用的是什么方法检测的，怎么确定的有明显凋亡呢？这两种Anexin v/PI 染色用的试剂盒是同一个？哪个公司的，货号是多少，下个说明书研究研究。
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skytree[使用道具]
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发表于 2012-8-29 17:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可能是因为洗涤一方面会丢失细胞可能丢失需要的细胞，另外一方面也会洗去非特异性吸附可以把凋亡峰洗出来。具体真正的原因也没有探究过。
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jrwyyplt[使用道具]
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发表于 2012-8-29 17:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
非常感谢各位战友的帮助：
1.是的，问题很不标准，我想“为何流式细胞仪检测凋亡细胞效率这么低？” 可能更合适。
2.因为流式相对较为昂贵，我之前用MTT、Hoechst 33342/PI、DNA ladder实验来确定药物浓度、时间曲线，明确凋亡存在，在两次流式结果不理想（凋亡细胞总体比例比较低<1%） 后，曾经怀疑试剂的问题，但是我用流式细胞仪分析凋亡的试剂染了几张片子，感觉还可以（Annexin V绿色荧光/PI红色荧光），凋亡细胞数目绝对不止1%。
3.步骤很简单：
把处理的细胞消化、中和、离心（1100转/min，5min）、PBS 洗2遍，
离心后都是直接倒掉上清的（而不是吸取上清的，会有问题吗？室温而不是在4度，是否会影响？）
２５０ｕｌ结合缓冲液重悬（没有调整细胞浓度？？），　取100ul加入Annexin v 5ul/PI 10ul避光室温15min后加入PBS 400ul 上机。
试剂盒是晶美的.说明书没有下载，该公司网页总是乱码。

染色后上机前洗的次数？ 不理解...
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feima+[使用道具]
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发表于 2012-8-29 17:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果您肯定有凋亡，那么就只有如下两个原因了，1，流式染色问题。2，上机问题。
我不知道晶美的操作方法，我们用的时BD的：
1，binding buffer ×2
2，调整至1×10……6次方，取100ul
3，Annexin v 5ul/PI 10ul避光室温15min，加400ulbinding buffer！

好像您用的都是PBS？？！！？？！！
ps和Annexin V结合必须在Ca离子存在的条件下，binding buffer就是起这个作用。您用PBS是不行的！

“染色后上机前洗的次数？ 不理解... ”——————染色后直接上机，马上！

您说用流式染色好的液体做荧光显微镜，如果没有Ca，也是不行的！！

还有，没有听您说对照。一定要作个阴性对照————正常细胞！

好运！
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dotaaa[使用道具]
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发表于 2012-8-29 17:37 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1.在PBS洗细胞之后，用250 ulbinging buffer重悬的，但没有调节细胞浓度（下次一定调整）
2.避光孵育15min后，晶美说明书上是用PBS啊 （？？ ），我也看到其他公司的试剂盒是加binding buffer 。但下次我会用binding buffer ！！
3.上次做了两个阴性 对照，一个不加bingding buffer，一个加binding buffer（都不染色）
4.计划下周在中心实验室做一遍（这几次都是在我们实验室做的）。
5请问BD公司的试剂盒贵吗？ 是否再用流式细胞仪做一遍药物浓度、时间曲线？
再次感谢！！！
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