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标题:[求助]大鼠肝原代细胞怎么就养不活呢？！

qqq111[使用道具]
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发表于 2012-8-30 13:16 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]大鼠肝原代细胞怎么就养不活呢？！


我用在体二步罐流法取的wister大鼠的肝细胞原代培养，胶原酶0.07％，取下来细胞显微镜下观察特别好，很干净几乎没有血细胞。可是培养几天细胞并没有贴壁，后自制 了鼠尾胶原细胞是贴壁了，可是不见生长，做MTT颜色特别浅，不知道是为什么。
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qqq111[使用道具]
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发表于 2012-8-30 13:17 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
自己分析了可能的几个原因，望有经验的专家指点一下哪个可能！
1.胶原酶的浓度不合适造成了细胞的损伤。
2.灌流液中没有通氧气使细胞活力不高。
可是细胞不应该这么娇贵吧
3.鼠尾胶原对细胞的有损伤，处理培养器皿后未用盐溶液冲洗干净。
4.培养基不合适。
我用的1640+10％FBS+0.1U/ml胰岛素+10ng/ml地塞米松。因为做过好几次都不成功，所以加了促进生长的激素。
5.肝原代细胞对MTT的反应就是不强，颜色浅是正常的？
不太可能啊，因为线粒体肝细胞可能比别的细胞还多呢。

我已经做过N次了，该想的法都想了，可是还是没有成功，望贵人相助！
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loli[使用道具]
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发表于 2012-8-30 13:18 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

培养基不合适。
我用的1640+10％FBS+0.1U/ml胰岛素+10ng/ml地塞米松。因为做过好几次都不成功，所以加了促进生长的激素。

try the formulation as follows:
DMEM/F12, 10%FBS, 10ug/ml insulin, 10ug/ml transferrin, 50ng/ml DXM, and optional 0.5%DMSO(protectant).
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dog002[使用道具]
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发表于 2012-8-30 13:19 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢，我试试，还有一个问题，前几次细胞取得很多，我冻存了一些，不知道可不可以用呢？！复苏会不会活啊
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TAT[使用道具]
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发表于 2012-8-30 13:20 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

培养基应该是没有问题的，我用过1640和F12，细胞都挺好的！如果你用的是进口的培养瓶的话鼠尾胶就没有必要再铺了。再试试吧，看你的方法应该是没有什么问题的，注意分离的细胞接种密度不要太高，也不能太低。
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gemei0115[使用道具]
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发表于 2012-8-30 13:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1.如果是细胞本身的问题（活力不行），那冻存也没多大意义。建议在做冻存时严格操作，以免进一步加大损失。
2.至于培养基，我同意楼上的观点。我用过1640和DMEM，效果都不错。
3.要注意防止污染。受感染的细胞活力有很明显的下降。
4.在取材和培养时要注意时间，不要太长。
我个人的几点建议：
1.注意防止污染和操作时间。
2.要是用进口的一次性瓶子的话，没必要铺基质，我自己做了觉得铺了效果还不好些。
3.建议在取材后做细胞活性的简单实验，例如台盼蓝染色，检测细胞存活率，这样可以看看是不是取材的问题。
4.还有就是你没提到的离心，时间和转速都不能太大，要不对细胞的活力有很大的影响。
5.做过很多次原代培养，我觉得培养中出问题的可能性不太大，但是提醒你注意一点，你的培养基本身有没有问题，内毒素合标吗……
只想到这么多，先试试吧，祝成功！
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qqq111[使用道具]
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发表于 2012-8-30 13:22 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我就是对台盼兰方法掌握的不好才郁闷呢，里面好多蓝色的絮絮，细胞颜色都差不多，不可能是纯的无色啊，因为周围都是蓝色的溶液，看不出是不是染兰了，55
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qqq111[使用道具]
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发表于 2012-8-30 13:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1000转离心十分钟行不行啊？
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发表于 2012-8-30 13:24 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请参考以下我所用的方法,或许会有收获.
需注意的是
1.通常用于大鼠原代肝细胞的四型胶原酶浓度用0.025%,人的原代肝细胞用
0.05%,虽说四型胶原酶只对结缔组织有分解作用，但浓度过高对肝细胞总归不好，而且也很浪费。
2.离心速度一般在800~1000转，5~10min,因为肝细胞密度较大，过大的离心速度易压碎细胞，离完后就得到一些细胞碎片了。
3.适当浓度铺好的鼠尾胶原在镜下观察呈树枝状，枝端有很多分叉像羽毛状，这样细胞才可以此为依附，牢牢地贴壁。
4.台盼兰的应用浓度是0.4%，按1：1的比例染色即可。
5.具体的培养基配方和步骤请看附件吧。我用的是小块组织培养法，因为加了肝细胞生长因子，细胞存活率 比较高，而且还能适当增殖。
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zsxan1990[使用道具]
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发表于 2012-8-30 13:25 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
1.台盼蓝染色：制备细胞悬液并做适当的稀释，取9份的细胞悬液＋1份0.4％台盼蓝，混匀，镜下观察计数。注意操作在3min内完成。否则部分活细胞也会染色，干扰计数。
我就是用这个方法做的，结果很明显。
2.1000转离心十分钟行，但我用的是800离5min，因为是原代的，可以进一步去除杂细胞，且离心效果也很好。
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