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标题:[求助]如何在24孔板内消化细胞以计数

H2O[使用道具]
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[求助]如何在24孔板内消化细胞以计数


我想绘制心脏成纤维细胞的生长曲线,细胞按10,000/ml接种24孔板后,每24小时消化3孔细胞,计数曲平均值。因为文献没有具体步骤的介绍,我自己根据以前在40ml培养瓶消化细胞的经验,设计步骤如下:
1每孔以PBS洗2遍
2每孔加1ml 0.25%胰酶,37度2分种,然后显微镜观察,细胞收缩立即加1ml DMEM(20%FBS)吹打,直至全部细胞消化下来。
3依次消化完另2个孔,计数。
请教大家,我这样设计步骤可以么?
谢谢!
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orangecake[使用道具]
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偶也很想知道24孔板内细胞消化的方法,嘿嘿!
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avi317[使用道具]
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在你的第2步中,如果不加DMEM也可以吧,因为你目的是细胞计数,不怕消化过度,只怕没有将细胞消化下来啊。
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orangecake[使用道具]
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在第2步中,每孔加0.5ml 0.25%胰酶就可以了吧
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lagua123[使用道具]
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呵呵,主要是胰酶浓度,消化时间把握好,0.5或者1ml都可以的
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xingyi08[使用道具]
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消化时间能定量当然最好,但我们实验室消化的时候一般用眼睛看,用消化液洗完吸出之后,可见24孔板里有白蒙蒙一片,轻轻晃动可见白蒙蒙的东西会成片掉下,表明已经消化好。
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H2O[使用道具]
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请问你消化的是什么细胞呢?是在显微镜下看么?
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yueban-1147[使用道具]
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ybbio消化的肯定不是心脏成纤维细胞吧。我想,用胰酶加EDTA消化是否效果更佳?
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rxcc33[使用道具]
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细胞消化下来仅仅是为了计数吗?

计数后的细胞还要不要?

如果仅仅是部分计数,其余的要继续培养的话

还是不要消化过久,免得对细胞造成损害

我们实验室的方法是

1.  吸干已长满培养单层细胞的细胞培养瓶中的培养液。
2.  加入PBS液冲洗2次。
3.  加入0.25%胰蛋白酶工作液(25ml培养瓶中加入约1ml;75ml培养瓶中加入2ml,24孔培养板约0.5ml),前后旋转培养瓶以便胰蛋白酶包被瓶内所有细胞。
4.  把细胞培养瓶盖松松拧上后置细胞培养瓶于37℃培养箱中。每隔半分钟将培养瓶拿出,用手猛拍培养瓶侧壁,使得瓶内的液体能带下将要脱壁的细胞。
5.  镜下检查细胞脱落情况,若无细胞脱落将培养瓶在放回培养箱中孵育,半分钟后拿出继续轻拍培养瓶,镜下观察见有大量细胞脱落时,即将胰蛋白酶工作液用吸量管吸出至事先加入胰酶中止液的离心管中,注意尽量不要让细胞成团絮状。
6.  在培养瓶中再加入2ml胰酶液,重复步骤3、4、5。镜下观察细胞,直至瓶内几乎没有细胞残余。
7.  将离心管置于4℃,1000rpm离心5分钟。
8.  弃上清液,在离心管中加入5ml培养液,轻轻吹吸,使细胞成均匀的细胞悬液,不要有肉眼可见的团絮状沉淀。

这样操作的优点是细胞不会成团,不管是对于计数还是对于传代继续培养都有好处
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wmp1234[使用道具]
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请教你一下,我正好很需要心脏成纤维细胞,不知您的细胞是那里建系的?背景是什么?意思就是说从心脏里面分离出的成纤维细胞吗?那心脏大多是心肌细胞,是从瓣膜分离培养建系的吗?还是元代阿?真的很希望得到你的回答和帮助。
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