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标题:[求助]如何减小MTT法中的吸收度?

biabiade[使用道具]
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[求助]如何减小MTT法中的吸收度?


因为刚弄懂MTT方法的吸收度在0.2~0.8之间误差较小,我是加90微升培养基,10微升5mg/mlMTT,4小时后扣板,加100微升DMSO,吸收度一般是大于1的,我想把吸收度控制在0.8以内,但因为我做的是关于细胞黏附方面,要测内皮细胞与白细胞总的的吸收度,想通过减少细胞数是不行的,那么有没有别的方法呢?
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xueyouzhang[使用道具]
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楼主的问题没有看明白哦 ,不知道为什么“关于细胞黏附方面,要测内皮细胞与白细胞总的的吸收度,想通过减少细胞数是不行的,”?
想学习一下,请楼主指明,谢谢。
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biabiade[使用道具]
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你好:白细胞黏附于血管内皮是炎症的起始阶段,关于细胞黏附方面的实验我是先将内皮细胞接到96孔板,当内皮细胞长至90%的时候,加入某些刺激剂,如某些细胞因子,使内皮细胞表面黏附分子表达增多,这时再每孔加入一定量的白细胞,这时活化的内皮细胞与白细胞黏附量会增加,一般黏附半小时以后,再用培养基轻轻洗掉未黏附的白细胞。我现在用的检测方法是MTT法,所得结果是内皮细胞与黏附上去的白细胞之和,减去没有加白细胞的空白组的吸收度就是反应黏附上去的白细胞的量。如果用某些药物作用了内皮细胞,可能会抑制内皮细胞的活化,进而减少它们的黏附。
我的问题是“结果是内皮细胞与黏附上去的白细胞之和”,一般在1.2左右,这样的误差是很大的,如果我减少内皮细胞的数量是不行的,因为内皮细胞是白细胞黏附上去的基础;如果减少所加的白细胞的量,那在最后“轻轻洗掉未黏附的白细胞”时所剩的白细胞就很少,虽然最后是用黏附率来表示,但还是增大了误差。用别的检测方法又较麻烦。
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dog002[使用道具]
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看懂了!!多谢群友的详细介绍,很厉害啊,心内科的吧。
只是我没有弄明白为什么你觉得“MTT方法的吸收度在0.2~0.8之间误差较小”呢?我老师告诉我是阴性对照组0.8-1.2都是很好的,药物干预组>0.2就可以了,再小没有什么意义了。
还有一点,既便是你的“0.2~0.8之间误差较小”是正确的,我对这句话的理解是:细胞在这样的OD值下面,相互之间影响较小(基本没有接触抑制,能真实地反应细胞生长的情况)。你的实验是不一样的,你的白细胞是粘附在内皮细胞上的,和我们一般的情况不同,所以我认为你的OD值可以大一点的。1.2一点问题都没有!
在实验室工作时间不长,没有什么经验,可能会让专家们见笑了。
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biabiade[使用道具]
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你好:"细胞在这样的OD值下面,相互之间影响较小(基本没有接触抑制,能真实地反应细胞生长的情况)",你说的我认为很有道理.我觉得“MTT方法的吸收度在0.2~0.8之间误差较小是因为前几天一位老师的指导:

这和分析化学中的 lambert-beer定律有关,1 对朗伯-比尔定律的偏离在吸光光度分析中,经常出现标准曲线不呈直线的情况,特别是当吸光物质浓度较高时,明显地看到通过原点向浓度轴弯曲的现象(吸光度轴弯曲)。这种情况称为偏离朗伯-比尔定律。若在曲线弯曲部分进行定量,将会引起较大的误差。在吸光光度分析中,仪器测量不准确也是误差的主要来源。任何光度计都有一定的测量误差。这些误差可能来源于光源不稳定,实验条件偶然变动,读数不准确等。

  在光度计中,透射比的标尺刻度均匀。吸光度标尺刻度不均匀。对于同一仪器,读数的波动对透射比为一定值;而对吸光度读数波动则不再为定值。

  吸光度越大,读数波动所引起的吸光度误差也越大透射比很小或很大时,浓度测量误差都较大,即光度测量最好选吸光度读数在刻度尺的中间而不落两端。待测溶液的透射比T在15%~65%之间,或使吸光度A在0.2~0.8之间,才能保证测量的相对误差较小。当A=0.434(或透射比T=36.8%)时,测量的相对误差最小。
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junhun[使用道具]
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你是否考虑在不减少细胞数量的前提下,不让内皮细胞长满90%,而只长40--60%左右,这样吸光度值会降低一些。
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biabiade[使用道具]
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很久没来了,谢谢!“不让内皮细胞长满90%,而只长40--60%左右“确实会使吸光度值降低,但我不知道这么少的内皮细胞是否会在我洗掉未黏附的白细胞的时候会受损,因为内皮细胞数相对多,长的相对较密的时候,受冲洗时所受的损伤相对轻一些。不过我可让内皮细胞长满70~80%的时候试试。感谢!)
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HP007[使用道具]
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你的结果是用黏附率表示的

所以个人认为你可以适当减少内皮细胞的量(不需生长至90%)试试

这样虽然黏附的白细胞总数会减少

但是黏附率应该没什么变化
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greenbee[使用道具]
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我的方法很简单,加大DMSO的用量,改为200ul
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dragonkilly[使用道具]
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加大DMSO应该不会有什么影响啊,因为加大了DMSO的量孔内的液体会变厚,吸收可能反而大了。加了200ul后再吸掉100ul还差不多。
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