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标题:[求助]一个关于病毒感染靶细胞的问题!

tudou85[使用道具]
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[求助]一个关于病毒感染靶细胞的问题!


我用重组质粒转染PA317,G418筛选后收病毒上清,将收集的病毒上清感染靶细胞却没有看到荧光。请各位老师帮忙分析一下原因,谢了,先!
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1.质粒大抽完后是否进行了鉴定,必须要保证质粒正确。
2.PA317包装细胞生长状态如何?
3.包装过程:用何种方法包装的,制一般用Superfect脂质体转染效果好。
4.病毒上清收集后用0.45um滤膜过滤一下,感染靶细胞之前最好先感染NIH3T3细胞测定一下滴度,这样感染靶细胞就比较放心了。
5.感染靶细胞一定要加8ug/ml Polybrene。
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另外目前用的包装细胞系,已经倾向于不用NIH3T3衍生来的细胞系,而是采用293T衍生过来的包装细胞系,如Bosc细胞系等。最高效的包装方法:用病毒载体和编码病毒蛋白的质粒(常用Ecopack质粒)共转染293T细胞,转染方法为脂质体介导法,48小时后收集上清,一般滴度都很高的,可以试试。
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tudou85[使用道具]
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感谢你的热心帮忙,还有两个问题想请教你
1。我们是做到用病毒感染NIH3T3细胞测定滴毒这一步就没有看到荧光,所以就没法测滴度,上次是我没说清楚。希望 给点建议。
2。你提到“目前用的包装细胞系,已经倾向于不用NIH3T3衍生来的细胞系,而是采用293T衍生过来的包装细胞系,如Bosc细胞系等”。后面说“最高效的包装方法:用病毒载体和编码病毒蛋白的质粒(常用Ecopack质粒)共转染293T细胞”。后面提到的‘293T细胞’与前面提的‘293T衍生过来的包装细胞系’是不是一回事?
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1.你用病毒感染NIH3T3细胞测定滴毒这一步就没有看到荧光,那很有可能你的包装效率低,病毒颗粒得率低,一般情况下,如果包装效率高的话,病毒上清感染NIH3T3细胞,48小时后流式分析可以有50%GFP阳性细胞呢。
2.我们用的很高效的方法:用病毒载体质粒和编码病毒蛋白的质粒(常用Ecopack质粒)共转染293T细胞,普通293T细胞。其实所谓的包装细胞系,也就是先把编码病毒蛋白的质粒转染到293T细胞中建成稳定株,如BOSC细胞。但是包装细胞系如果传代数过高,包装效率就大打折扣了,所以目前好多牛实验室用病毒载体和编码病毒蛋白的质粒(常用Ecopack质粒)共转染293T细胞法来包装病毒,安全方便且高效。
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小荷尖尖[使用道具]
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我也做过一段时间的腺病毒转染试验。当时用腺病毒上清液只是用来转染293细胞,因为这种细胞能够为腺病毒提供扩增和包装的场所,所以对腺病毒上清液的滴度要求不高,但是加入的上清液的量比较多3-4ml/10ml培养基。这样培养56小时就能够见到强烈的荧光了。也试过用上清液转染HUVEC细胞的,但是上清液病毒滴度实在是太低了,而且细胞内不能提供腺病毒扩增和包装的必要条件(delta E3和delta E1区域),所以是很难看到荧光的,即使你的腺病毒构建和包装都没问题。所以,建议你看看,你的病毒是不是能在靶细胞中增殖包装,然后砸你决定是否用上清液转染。如果,不能的话,那就做病毒的纯化吧,虽然这个过程很烦,但是这样才能有效的提高转染成功率。
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tudou85[使用道具]
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不过我还有3个问题想请教你:
1 我用的质粒是逆转录病毒载体,不知293T可否包装逆转录病毒?
2 为什么要用流式分析GFP阳性细胞呢?难道是分辨率高吗?能发现倒置荧光显微镜下观察不到的发荧光的细胞吗?我是感染病毒48h后在倒置荧光显微镜下观察荧光的。
3 你的Ecopack质粒是从哪里获得的呀?我如何买到啊
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小荷尖尖[使用道具]
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1.293T完全可以用来包装逆转录病毒。
2.倒置显微镜下如果荧光强的话也可以看的,但是我们测定滴度一般用96孔板,视野小,另外,如果要算滴度的话,需要用GFP阳性率换算滴度的,所以我们用流式分析的,很EASY的,无需特殊处理,把细胞消化下来,PBS重悬,直接上流式分析即可。
3.Ecopack质粒国内好像不易买到,大多数都是从国外带过来的,你可以让你老板出面帮你搞定。这个东东有了,其他的就好办了。
希望你顺利。
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tudou85[使用道具]
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我查了好多公司的目录,都没有找到Ecopack质粒,而我现在急需这个质粒,我能否买你的呀,如果你能卖给我,那就感激不尽了
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小荷尖尖[使用道具]
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I am sorry!
Ecopack质粒的所有权归老板,我帮不了你。
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