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标题:[求助]外周血单核细胞分离

爱老虎游tt[使用道具]
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发表于 2012-8-31 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]外周血单核细胞分离

我在分离人外周血单核细胞过程中，遇到一点问题，想请教各位高手，多谢先！
1.1ml外周血约可以分离出多少单核细胞数？
2.离心后发现细胞团块中混有少量红细胞，原因何在？如何避免？
3.我需要单核细胞涂片，做免疫组化，想请教最佳涂片细胞浓度及涂片方法、固定方法？
4.为何在将细胞团块吹打过程中，有时会遇到像膜状物样的东东，吹打不开？如何吹打不损伤细胞？
谢谢各位不吝赐教！多谢！
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eric930[使用道具]
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发表于 2012-8-31 17:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

外周血中单核细胞含量为3％－8％，如果离心后发现混有红细胞可用红细胞裂解液进行处理，效果比较明显。吹打时可多加一些溶液，易于细胞团分开
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发表于 2012-8-31 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢你，有什么办法避免出现红细胞吗？
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wood533[使用道具]
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发表于 2012-8-31 17:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

基本上还是很难的。我曾采用dextran T500沉降后收集上清再离心的方法，仍有部分RBC残留，国外文献报导也指出了有少量RBC的缺点。请战友关注
cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=3994009&sty=1&tpg=1&age=0')
有问题也可以在这个贴里提出，大家一块来交流，一块来学习，提高。
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爱老虎游tt[使用道具]
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发表于 2012-8-31 17:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我曾经试着多加液体吹打细胞团块，仍有膜状物存在，不知是不是细胞？
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发表于 2012-8-31 17:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

膜状物？吹打后是否能成团？如果是的话，很不幸，您的细胞估计已经损伤了。
如果不是成团，而是有点混，或有点浊，那倒是正常的呀，细胞离心后管底有层白白的pellet，加液后有点浊是正常滴。
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爱老虎游tt[使用道具]
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发表于 2012-8-31 17:34 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是有点混浊，但有时也有小的膜状物，我一个同学养这种细胞，他分离外周血单核细胞时也发现这种现象，都不知原因？
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junjie05[使用道具]
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发表于 2012-8-31 17:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

破红建议还是用蒸馏水为好，
加入少量蒸馏水，
混匀几秒，
立即加入双（多）倍量的1640稀释即可。
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爱老虎游tt[使用道具]
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发表于 2012-8-31 17:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
是在加Ficoll分离单个核的时候还是分离后加蒸馏水？多谢多谢赐教！
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tuuu2[使用道具]
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发表于 2012-8-31 17:35 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

涂片最好的方法是用离心涂片机，方便，快捷。但是这个仪器不是每个试验室都能置办得起的，英国产的Shandon Cytospin II型机器用过效果很好，但是较贵，国内也有一些厂家生产，很便宜，但没用过不知效果如何。如果实在不想花钱的话，直接滴在载玻片上（用多聚赖氨酸处理可增加细胞的粘附性)也可以。
另外由于单核细胞能紧密贴附在玻璃或塑料上，你也可以在6孔板内放入一块盖玻片，然后将细胞悬液滴在上面，37oC孵育2小时或过夜，再取出玻片，用PBS轻轻冲洗去掉碎片什么的，晾干就能用了
具体细胞数你可以自己摸一下，没有定数，只要细胞比较分散，能分清单个细胞的形态即可
固定方法我原来的试验室常用纯丙酮 固定10-20分钟，自然风干，马上用或放在4oC冰箱以后用也行，国外也有用多聚甲醛固定，一般是4%（注意不是直接买来的那种液体甲醛，需要经过蒸馏获得的）
1ml好像能分出10的6次方个单个核细胞，经过贴壁纯化单核细胞，按上面的含量计算。
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