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标题:[求助]上传细胞骨架染色的图片，请指教

cj_mondy[使用道具]
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发表于 2012-8-31 17:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]上传细胞骨架染色的图片，请指教


各位大侠，这是我做的细胞骨架考马斯R250染色的照片，效果不是很好，我是想问一下，那些篮染的真的是细胞骨架吗？细胞骨架应该很小的啊，怎么会在普通光镜下都能看见呢？谢谢各位了！


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2012-8-31 17:42
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cj_mondy[使用道具]
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发表于 2012-8-31 17:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做的是卵巢癌组织的染色，具体方法是：
1，PBS冲洗
2. 1％TRITON X 100 37度 孵育30分钟
3.PBS冲洗
4.3％戊二醛固定 30分钟
5.PBS冲洗
6.0.25考马斯R250 染色20分钟
7.自来水冲洗既可观察
结果如上
谢谢指教
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fklo83[使用道具]
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发表于 2012-8-31 17:42 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

应该先用戊二醛固定再用triton x100 穿透，你的顺序弄反了。triton浓度为0.1~0.3%即可，室温10min，用PBS配制。2-3%戊二醛固定，室温20－30min即可。如果先穿透，细胞膜溶解，细胞就变形喽。
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fklo83[使用道具]
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发表于 2012-8-31 17:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

当然我的是免疫荧光的经验，可能做细胞骨架有特别之处，要先用triton去膜再固定。你的背景太高，考马斯蓝配制好了最好过滤一下，普通滤纸即可。
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cj_mondy[使用道具]
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 小中大

真的是光镜都能看到细胞骨架啊，我一直以为要电镜才可以呢，谢谢
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发表于 2012-8-31 17:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
光镜可以看到细胞骨架的，R250是蛋白的非特异染色，triton x100 的作用是破膜，骨架是细丝状的。你的细胞已经变形了，而且染的也不好，我正在做此试验。细胞骨架最好用激光共聚焦，用带荧光标记的鬼笔环肽。透射电镜也行。希望版主加分，急需得到十分看几个帖子。
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发表于 2012-8-31 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
光镜可以看到细胞骨架的，R250是蛋白的非特异染色，triton x100 的作用是破膜，骨架是细丝状的。你的细胞已经变形了，而且染的也不好，我正在做此试验。细胞骨架最好用激光共聚焦，用带荧光标记的鬼笔环肽。透射电镜也行。希望版主加分，急需得到十分看几个帖子。

还望叙述的稍微详细点，能真正帮楼主分析一下失败的原因
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发表于 2012-8-31 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的具体方法如下：
细胞骨架染色
○1 取出多孔板爬片细胞用PBS洗3次、每次5min。
○2 用1.5％Triton-x100．振荡洗涤3次．每次8min。
○3 用M－缓冲液振荡洗涤3次．每次4min。
○4 3％戊二醛固定10min。
○5 用M－缓冲液轻洗3次、每次3min。
○6 用考马斯蓝液染40min，然后用PBS洗去多余的染液．空气干燥。二甲苯透明、树胶封固。
○7 相差显微镜下观察、摄影
绝招全使出来了，希望版主加分。文献上有很多方法，我也都试过，也失败了好多次，感觉这种方法好些。也很省钱。但细胞骨架最好用激光共聚焦，用带荧光标记的抗体，图片很漂亮，也很能说明问题，抗体贵些
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阿司匹林[使用道具]
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发表于 2012-8-31 17:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

对细胞骨架方面的一些东西感兴趣，很想向群友请教一些问题，不知能否有其他联系方式，方便请教，呵呵，真心求教的！
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dog002[使用道具]
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发表于 2012-8-31 17:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不知道楼主的目的是什么？而且骨架一般都对温度和buffer很敏感，特别是微管，如果要先对细胞抽提然后固定，那么buffer肯定是不能用PBS了，而且
triton -x100的浓度和时间都有讲究，时间稍长都解聚了。
这里有个网页是讲免疫荧光染骨架的，不知道对楼主有没有帮助
cuturl('http://mitchison.med.harvard.edu/protocols/gen1.html')
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