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标题:[求助]DNA LADDER实验

leifengta[使用道具]
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发表于 2012-9-1 13:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]DNA LADDER实验

昨天跑了一块胶，如图所示。
实验步骤大致如下：药物处理后收集全部细胞，裂解液（tris.hcl 10mmol/L;ECDTA 10mmol/L; NaCl 10mmol/L; 1%SDS; 100ug/ml proteinase K）37度过夜；加入RNaseA 100ug/ml, 37度1小时，离心，取上清跑电泳。
（这个程序是按照以前师姐的论文做的，除了没有加NP－40）
请问前面高亮的带是什么？
还有NP－40，我查了是湿润剂，具体是作甚么用的呢？
请各位老师帮忙！！多谢啦！


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2012-9-1 13:29
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leifengta[使用道具]
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发表于 2012-9-1 13:29 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
从紫外灯下能看到ladder，但是前面的带太亮了，照片就显示不清了
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 小中大
感觉前面的亮带有点像没有被消化降解的RNA，
还有就是感觉你收集的细胞是不是死得太彻底了，怎么只有小片段，大的核酸片段去了哪里？？ 疑惑中
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rxcc33[使用道具]
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发表于 2012-9-1 13:30 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

前面的亮带应该是没有跑开的DNA，因为DNA ladder是一个凋亡晚期事件，所以药物对细胞必须有足够强的作用力才能产生ladder,我建议你可以的把作用浓度增大或是延长作用时间。我也做了一个学期的DNA ladder,开始怎么也做不出来，后来调整了给药浓度及时间就做出来了。
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leifengta[使用道具]
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 小中大
我将自己的实验步骤贴出来，你试试
取2×106细胞，加入500µl细胞裂解液（10 mmol/L Tris-HCL pH7.4、10mmol/L EDTA、150mmol/L NaCl、0.5%SDS 、50mg/ml RNA酶）37℃处理30min，再加入0.1mg/ml蛋白酶K50℃处理3h，然后用等体积酚/氯仿抽提两遍，12000g×5min离心，收取上清,然后加入1/10体积的3mol/L的醋酸钠和2.5倍体积的无水乙醇-20℃过夜沉淀DNA。12000g×10min离心，沉淀用TE溶解，加入0.1µg/ml EB，进行15g/L琼脂糖电泳。
后来我用国产的DNA抽提试剂盒，作出来的结果很漂亮。
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dog002[使用道具]
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 小中大

请问什么是ＤＮＡ　ＬＡＤＤＥＲ，这项技术的目的是什么？
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utt0989[使用道具]
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发表于 2012-9-1 13:32 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
在细胞凋亡时，内源性Mg、Ca依赖性核酸内切酶被激活，切割细胞DNA，使其成核小体间DNA链的断裂、大分子DNA链的断裂及DNA单链的断裂。其中以核小体之间DNA断裂时最多见的一种断裂方式，断裂形成的DNA长度为核小体DNA长度的整数倍，即180～200bp的整数倍。通过提取凋亡细胞的基因组DNA在1.5~2%(一般是这个浓度^_^)琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察可见到特征性的“梯状”（ladder）DNA条带。此称DNA LADDER实验。而坏死的细胞DNA则成模糊的弥散条带。
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utt0989[使用道具]
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 小中大

用于定性、定量（书上说）检测细胞凋亡。
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leifengta[使用道具]
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发表于 2012-9-1 13:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
感觉前面的亮带有点像没有被消化降解的RNA，
还有就是感觉你收集的细胞是不是死得太彻底了，怎么只有小片段，大的核酸片段去了哪里？？ 疑惑中

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我采用的方法是选择性提取小分子量DNA，所以基因组大片段都没有提出来。
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fei1226com[使用道具]
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发表于 2012-9-1 13:33 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我将自己的实验步骤贴出来，你试试
取2×106细胞，加入500µl细胞裂解液（10 mmol/L Tris-HCL pH7.4、10mmol/L EDTA、150mmol/L NaCl、0.5%SDS 、50mg/ml RNA酶）37℃处理30min，再加入0.1mg/ml蛋白酶K50℃处理3h，然后用等体积酚/氯仿抽提两遍，12000g×5min离心，收取上清,然后加入1/10体积的3mol/L的醋酸钠和2.5倍体积的无水乙醇-20℃过夜沉淀DNA。12000g×10min离心，沉淀用TE溶解，加入0.1µg/ml EB，进行15g/L琼脂糖电泳。
后来我用国产的DNA抽提试剂盒，作出来的结果很漂亮。贴在附件里。
请问大侠：我正准备用国产DNA ladder提取试剂盒，是北京鼎国的，说明书里说用0.8%的琼脂糖，但文献报道好象没用这么低的浓度，不知你的试剂盒是哪个公司产的，你附的文件我下载后打不开。非常感谢！
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