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标题:[求助]分离真表皮的方法

雪山飞鹿[使用道具]
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发表于 2012-9-1 13:43 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]分离真表皮的方法

我想将小鼠皮肤的真表皮进行分离，然后获取表皮细胞，相关文献说可以用中性蛋白酶来分离较好，我查了很多家试剂公司都没有这种酶卖，不知哪位高手做过能够给予指点，先谢了。
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pencil菲[使用道具]
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发表于 2012-9-1 13:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我在培养皮肤表皮细胞,回答如下:
1.表皮的分离可以采用两步消化法:
首先, dispase酶(2.4U/ml)4度过夜消化(据说小鼠消化的时间为5-6h),然后用眼科镊分离表皮,然后采用0.25%的胰蛋白酶常温震荡消化5-10min,血清终止后吹打,200目筛网过滤即可获得较多细胞.另外胰酶也可以代替dispase.
dispase Gibco公司的 17105-041(5克）
另外 德国reco公司也有.
请斑竹加分!
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ffooll[使用道具]
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发表于 2012-9-1 13:44 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
请问你的dispase买的多少钱？
我以前也找过，但是太贵了，5克要1000多，我也要不了那么多，后来用胰酶做的，有细胞，倒是数量不够。
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ffooll[使用道具]
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发表于 2012-9-1 13:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我在培养皮肤表皮细胞,回答如下:
1.表皮的分离可以采用两步消化法:
首先, dispase酶(2.4U/ml)4度过夜消化(据说小鼠消化的时间为5-6h),然后用眼科镊分离表皮,然后采用0.25%的胰蛋白酶常温震荡消化5-10min,血清终止后吹打,200目筛网过滤即可获得较多细胞.另外胰酶也可以代替dispase.
dispase Gibco公司的 17105-041(5克）
另外 德国reco公司也有.

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另外还想请问：我分离表真皮时，怎么就分不清哪是真皮，哪是表皮呢？虽然文献上说什么颜色较深的是表皮，颜色较浅的是真皮，但是消化后小皮条都缩成一团了，根本看不清。还有小鼠身上那么多毛，你是怎么处理的？刮毛吗？好像怎么刮都刮不干净，做出来的细胞里面老是有很多杂质，视野不清楚。不知道你是用的什么方法？可否讨论一下！
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987789[使用道具]
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发表于 2012-9-1 13:45 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做的是人的(包皮)皮肤角质细胞培养,所以不涉及你所说的问题,你的小鼠是多大的,据说不要超过5天的.
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发表于 2012-9-1 13:46 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我做的是人的(包皮)皮肤角质细胞培养,所以不涉及你所说的问题,你的小鼠是多大的,据说不要超过5天的.

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哦，那是胎鼠吧
我当时用的是四周左右大的，后来还做过大鼠 豚鼠。都存在分不清表真皮的问题，后来我就直接取表皮，做是做出来了。但是杂质多，细胞数量也不多。你分表真皮时，分得出来吗?
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 小中大
我们实验室手动分离表真皮的，
一般就是取幼鼠（3d）皮肤全层，去除皮下组织，切成0.5×0.5的组织小块，0.25％胰酶4度消化过夜，24h捞出来手动分离，一拉就分开了。表皮是银白色的，真皮有些透明，再分离自己所需要的细胞
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发表于 2012-9-1 13:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我做了预实验，用成年大鼠的皮肤，dispase消化过夜后比较容易分离真表皮的，谢谢大家的帮助
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xueyouzhang[使用道具]
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发表于 2012-9-1 13:47 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
有不少朋友继续问我后面怎么分离ＥＳＣ，翻出老帖了。希望对大家有帮助

我们一般是表皮切碎后用胰酶消化８分钟，血清中止，吹打成单细胞悬液（细胞出来了），离心后，细胞就留底了，加入培养基，继续吹打成单细胞悬液，接种于培养瓶。镜下可以看见很多形态上像ＥＳＣ的细胞，如果不要求很纯就到此为止。

纯化干细胞：利用ＥＳＣ对鼠Ⅳ型胶原的快速黏附，前一天晚上将鼠Ⅳ型胶原铺满培养瓶底，将单细胞悬液接种于此培养瓶，孵育20ｍｉｎ，换液就差不多了。如果还要纯就，消化下来，重复前面黏附。
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zhenxin[使用道具]
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 小中大
好,我是今年刚刚开始接触ESC,现在整个一小白,希望以后能得到你的帮助.也期望你能发几张ESC不同时期的照片.先谢谢了.
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