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标题:[求助]成纤维细胞培养？

xue258[使用道具]
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发表于 2012-9-3 13:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]成纤维细胞培养？

各位大侠,小弟最近开始进行成纤维细胞的培养，取材来自手术切除的皮肤
，第一次采用了组织块法培养，但已经6天了，始终未见到组织块周围有细胞游离出来，只是瓶底有散在的有一定数量，贴壁的圆点。

我用的培养基 hyclone的DMEM（低糖）＋10％小牛血清（成都哈里），
方法是按照书上采用的组织块法

顺便再请教一个问题，一般培养瓶中贴入多少组织块为宜。
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xue258[使用道具]
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发表于 2012-9-3 13:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

前天临床上取材又进行了一次培养，这次改用酶消化法

hyclone的DMEM（低糖）＋10％小牛血清（成都哈里），0.25％胰酶

取材后抗生素PBS冲洗干净，修减组织成1mm3大小的，置锥形瓶中，37度，200rpm消化1.5h，取上清后加入培养基离心2次，悬浮后接种至培养瓶中，现大多细胞已贴壁，但细胞仍呈圆形，未见分化，请各位高手指点小弟
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发表于 2012-9-3 13:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我来说两句吧，以前做过胎儿皮肤成纤维细胞的原代培养，看能不能帮到你。
1.首先，组织块培养时，每小块间距5mm左右，常用的50ml的培养瓶，放置25块左右。要保证标本的新鲜。但我以前做的时候效果也不是太好，细胞虽有游出，但量少，且生长缓慢，最后放弃，改消化法。
2.你消化的时候，200rpm消化1.5h是离心消化？为什么要采用这种方法？常用的是振荡消化或者磁力搅拌消化，如果没有上述设备，可隔10min手动摇动。另外，1.5h个人感觉有点长，可改变一下消化时间试试，当时我用45min效果已很好（胎儿皮肤）。
3.如果细胞状态不好，可增加培养基中血清的量试一下。
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is2011[使用道具]
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发表于 2012-9-3 13:50 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的情况和你差不多，也是采用两种方法，酶消化法是昨晚做的，细胞都还没贴壁，请问你的细胞是多久贴壁的？我消化的时间比你长，2－3的小时。也想请问这些细胞是不是我们想要的成纤维细胞呀？
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xue258[使用道具]
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发表于 2012-9-3 13:51 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我跟着别人学的时候，别人就是这样作的，细胞长的很好。
我的细胞48h后已经部分贴壁，但总体来说情况不是太好，现在在再找原因！
另，消化1.5h已经很久了，太久了对细胞有损伤
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 小中大

我的组织块法培养是6、22号做的，也是始终未见到组织块周围有细胞游离出来，只是瓶底有散在的有一定数量，贴壁的圆点，但怀疑那些是脂肪细胞。我们两个做得差不多，建议相互交流下情况。也希望园里其他做过的朋友，讲一下经验。
谢谢
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viviwang1987[使用道具]
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发表于 2012-9-3 13:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

参考本人帖子【原创】小鼠肺组织分类培养（内皮，上皮，成纤维）
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发表于 2012-9-3 13:52 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

请问楼上，我怎么搜索不到你说的帖子呀？请问组织块法培养成纤维细胞，现在见到组织块下面有些圆形、亮点细胞，呈葡萄串状，请问这些是什么细胞呀，是成纤维细胞吗？怎么不长出来呢？（肯定不是真菌）
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jrwyyplt[使用道具]
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发表于 2012-9-3 13:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

淋巴细胞，不要管他，每天换液即可除去，淋巴细胞不贴壁。一般组织块培养3天后可见细胞游出。你要有点耐心。
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xue258[使用道具]
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发表于 2012-9-3 13:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的组织块法进行培养，一直等了12天，才有两个组织块边缘有成纤维细胞长出来。

另外，4天前用胰酶消化法作的，一开始贴壁的细胞还有一些，但现在数量感觉较以前减少

于是找了同学要了一瓶细胞，昨天进行了传代，今天去看，细胞已经贴壁，镜下成梭形，故考虑可能不是培养基的问题，可能是上两次作原代培养时不知什么地方操作出了问题，请各位高手一起来讨论一下
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