小中大我做过该方法。步骤如下，希望对你有帮助：
1 细胞涂片，自然吹干；
2 4％多聚甲醛固定10 min（若不想当时接着进行实验，可以将玻片放－20度保存，我最长时间放过3月，结果染色也很好）；
3 0.2％Triton X-100破膜，置冰上10min;
4 封闭30分钟，室温；
封闭液：含3％BSA＋0.02％Triton X-100 的PBS中
5 一抗（37度1～1.5h,或者4度过夜），注意浓度（按抗体说明书要求摸浓度）；PBS洗3遍；
6 FITC标记二抗作用30min（室温），PBS洗3遍；
7 Hoechst 33258染核20分钟，PBS洗1遍；
8 甘油缓冲液封片
在普通荧光显微镜下，使用不同的激发光，可以看到胞膜（绿色）和胞核（蓝色）。Confocal下可以要用不同的激发光波长激发（具体多少记不清了，可以跟操作的老师提示，使用了何种染料，他们根据情况进行选择），采集图片时，可以同时获得同一视野下，三张不同染色的图片，胞膜（绿色，FITC标记的）、胞核（蓝色，Hoechst33258标记的）和胞膜胞核同时显色的合并图片（该图片是两种激发光同时激发时采集的图片）。
你的情况可能是没封闭，DAPI染色时间短；还有在观看荧光显微镜和Confocal时要使用不同的激发光才能看到2种不同的颜色。
