[求助]淋巴细胞培养出问题－－原因找到！

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标题:[求助]淋巴细胞培养出问题－－原因找到！

yapuyapu[使用道具]
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发表于 2012-9-3 16:06 资料个人空间短消息加为好友

小中大

最近两次培养淋巴细胞，
培养1天后几乎全军覆没！
自认为应该注意的因素都注意到呢，
水平离心，避免急刹车，PH值7.2左右....这些因素都考虑的了的，
可不知怎么的，
还是原来的方法，
只有两个地方发生了改变，
一个是cona的浓度变为7ug/ml，
还有就是细胞瓶由小细胞瓶变为大细胞瓶呢，
可这应该不会有影响吧，
首先大的细胞瓶师兄培养细胞没有出问题，
排除细胞瓶问题；
另外cona的浓度，比这大和比这小的都试过，
也没有出现这种情况！

哪位站友帮我分析分析，原因可能出在哪些地方？
谢谢呢！

yapuyapu[使用道具]
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发表于 2012-9-3 16:07 资料个人空间短消息加为好友

小中大

最近又重新培养呢下PMBC，
改为以前的条件呢，
5ug/ml　cona刺激，
双抗　100U/ml,
死亡率还是很高，
达80%？
也不知是哪个环节出现呢问题？

是cona失效呢吗？我不是用pbs缓冲液之类稀释的，而是用的超纯水稀释，不知有无影响？我cona是5月中旬买的，不用的时候都放在－20度冰箱的？
这细胞培养不活，实验就停止不前呢啊？

大家帮我出出主意！

lixi559[使用道具]
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发表于 2012-9-3 16:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

pbmc中，你需要的是那一种细胞？ t 细胞， b细胞，nk细胞，还是单核细胞？
你以前这样的条件培养是不是培养成功？
一天全军覆没是什么概念？污染了，还是崩解了？加到培养瓶后，有没有观察细胞的形态？记数了么？
呵呵，其实还有很多环节，我们来一一排查：）
1：淋巴细胞分离液，有没有换？有没有污染？不同厂家的淋巴细胞分离液体，密度不同！！！离心时候的转速也不同~~~
曾经我用过北京夏斯的分离液体，细胞怎么都养不活，我也跟他们反映了，可根本就没有人理：（
2：1640颜色如何？不要管ph值（某些原因，造成仪器测量不准确）多少，看颜色与你以前配置的是不是差不多。1640用了多久了？要是超过半年了，建议最好重新配制
我的配方是：
1640干粉
L-glutamin 300mg
丙酮酸钠 110mg
heps 1 g
庆大霉素 5万单位
NAHCO3 适量
2巯基乙醇 3.7微升
加水500-800ml溶解后，定容至1000ml！！（有人说是定容到900ml，那是错误的，应为不能把小牛血清的那10%算进去的！）

3.好了排除了培养液和分离液体，我们再来看看，培养条件！
刚分离的淋巴细胞，在显微镜下观察的时候，可能由于有血小板，红细胞等的混入，细胞背景很杂乱，但是圆圆的，透亮的淋巴细胞还是能看到的，并且按照1ml新鲜血分离得到10的6次方pbmc来算，应该排列比较紧密才多，如果比较稀疏，那就是细胞密度没有达到，会影响细胞的生长。所以一般我种24孔板的密度是1-2x10的6次方。然后添加1640+10%ncs 1ml/孔+50U的il-2 /孔（因为我需要T细胞）+抗CD3或者PHA ,cona等刺激物。第3天换体液，添加il-2。嘿嘿，小细胞就会幸福的生长到另你兴奋的地步……

哦，差点忘记了，你的培养瓶，吸管等能严格保证质量么？罗嗦了这么多，不知道对你有没有用，但是我觉得，除非是污染，不然不会一天细胞就完蛋的！

baidukk[使用道具]
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发表于 2012-9-3 16:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

你说:'嘿嘿，小细胞就会幸福的生长到另你兴奋的地步……"

这句话真的让我非常非常非常向往,可惜只出现在我梦里.

我用抗CD3抗体刺激的PBMC,想得到T细胞.已经两周了,只有很少的增殖,死的比活的多.是浓度不对吗?你通常用什么浓度?

我的msn :zhang_yingyu@hotmail.com E-mail:zhang_yingyu@163.com

如果你看到我的留言,拜托和我联系一下吧!beg u!

yapuyapu[使用道具]
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发表于 2012-9-3 16:08 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先，我培养的是单核细胞，以前培养时条件是相同的，存活率也比较高！
　　我所说的全军覆没是指细胞全部死完呢，通过染色观察得出。
　　另外我的淋巴细胞分离液没有换，也应该没有污染的，用前是将其分装的，用的是TBD的分离液，效果还可以；
　　1640是哪种浅红色吧，颜色基本上没有变化，也应该不是1640的问题；另外我用的1640是师兄配好了的，直接给的，以前培养过程中也没有出现全部死光的情况；
　　淋巴细胞的浓度应该是符合标准的，大概是5－10＊10的6次方之间，另外我是用细胞瓶培养的，1瓶4ml1640吧，当然细胞用1640稀释后并没有马上测存活率，而是培养一天后再测的，也许是刚开始培养时就由于一些原因导致细胞死（下次做时注意一下）；
　　培养瓶，吸管都和原来一样；
　　我曾想是否是cona失效导致丧失生物活性，而无法刺激淋巴细胞增殖，可没用时是放在－20度冰箱的，按理说不会失效的。只有上次做离心时在4度放了20分钟，估计是有影响呢，但以再往前做时这个细节是注意了的。
　　应该说做的过程的各个细节都是与原来一样的，也不排除是由于污染的原因，也有可能是天气太热的原因，对细胞有影响（每天热天，实验室的细胞好象都长不好），但在室温操作的时间并不长，难道影响也大？
　　分析来，分析去，感觉也没有找到主要的原因，也有可能是各个环节都有些小失误，个人没注意，最终导致细胞以死亡来抗议吧！
　　决定把所有的东西都重配一下，再来试试！
　　也真希望“小细胞就会幸福的生长到另你兴奋的地步……"

c86v[使用道具]
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发表于 2012-9-3 16:09 资料个人空间短消息加为好友

小中大

广大战友，现在我放出一个有关“脐带血分离提取单核细胞”的老话题，但是内容绝对新颖，我在版块里还没有发现过同样的问题，有兴趣大家一起来分析分析。由于目前我们只有小容量的离心机，因此一直在做小量（１２ml／管）脐带血的分离，现在流程已经很熟练了。但是遇到了一个问题，很久无法解决。
　　我们每次先将抗凝的脐带血和生理盐水稀释后离心（１：１混合），顺利的取出白细胞、血小板的细胞层（当然混有部分红细胞），再加在ficoll上（密度１。０７７，上海华精生产，量也足够多，和细胞悬液的比例至少３：２），加的很顺利，分层清晰。可是在２０００r／min，２０min离心后，奇怪的分成了六层，由上而下依次是１盐水层２单核细胞层３红细胞层４ficoll层５粒细胞层６又是红细胞层。而不是想象中的５层（没有上面写的第三层）。好象红细胞没有都被离心到管底，而是分为两部分，也就是我写的３、６层。这样正常吗？这样我取单核层时会混有很多红细胞，而理论上单核层是不应该和红细胞层接触的（上面是水和血清的混合、下面是ficoll液）才对。我加大了离心时间和速度，达到３０００r／min，３０min后依然如此。我想不通问题在哪里。
　　a．两次离心的离心力、时间没有问题吧？
　　b．是不是由于脐带血的问题（因为有采集后２４小时才做分离，可是现采的一样有这种现象）？
　　c．还是淋巴细胞分离液的问题（品质）？
　　d．还是由于脐带血中混有抗凝物质（用的采血袋，内含枸橼酸等抗凝剂，不是单纯的肝素．每袋可以采２００ml，但是实际脐带血只有７０ml左右，会不会过度抗凝溶血了，溶的红细胞无法通过ficoll，而和单核混在一起，看起来好象是红细胞，形成我上面写的第３层）？以上是我的一点不成熟的考虑，请您指点．
　　谢谢！

idea2011[使用道具]
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小中大

我也在做淋巴细胞，我一般取4ml外周抗凝血，可是分离得到的细胞的量比较少，大概有6-8ml 5*105浓度的细胞，你能分离多少细胞，还有丁香海豚，IL-2什么时候加入呢，刚培养的时候加还是3天后再加，期待你的回答

c86v[使用道具]
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发表于 2012-9-3 16:10 资料个人空间短消息加为好友

小中大

刚开始培养和3天后加入，基本上没有区别~~
分离淋巴细胞，最最容易丢失的就是，刚把分离出来的“白层”吸出，加入到1640内离心洗这步，关键是：1.提高转速，至少比分离的那20分钟提高200-300转/分，离心10分钟。2.然后就是1640的量要足！！要比吸出的“白层”大至少4倍体积。这样，得到的细胞大概是1x10的6次方/ml~~~~

yapuyapu[使用道具]
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小中大

最近淋巴细胞培养也还是问题不断，
最好一次存活率40%左右（培养一天），
这次1640是新配的，
血清量也加到了15%，
不过清洗过程用的是D－Hanks液，
而不是1640，
我想影响应该不大吧！
再次来排除各种原因：
细胞瓶？是新的，不过由实验人员处理过了，难道没有处理好！
是细胞密度没有有达到？我估算了一下，大概细胞密度在0.7＊10的6次方左右，是不是偏小呢有影响？
怕污染，我的其中一个瓶子青链霉素加到300个单位/ml，还是死完了！

细胞做到这份上，
也真郁闷，
原来细胞培养得还行，
到现在细胞都培养不活呢，
痛苦至极呀！

caihong[使用道具]
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发表于 2012-9-3 16:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做了两次，两次都被污染了，细胞养了没几个小时就全都死光光了，只有大片的细菌，细胞连个碎片都没有了，另外请问楼主，你分单核细胞和淋巴细胞是怎么分得呀，我用贴壁法和PERCOLL都分不好

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