细胞世界 » 讨论区 » 经验共享 » [求助]bacmid提取

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 12  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:[求助]bacmid提取

www.1[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75147
精华 1
积分 533
帖子 641
信誉分 102
可用分 4121
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
1

发表于 2012-9-4 11:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]bacmid提取


我抽提杆粒已经好几次了，结果都不理想，老是有好几条带。不知道其电泳图应该是什么样的？请帮帮我！谁做过给我发张图可以吗？谢谢谢谢！！
顶部
baidukk[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77444
精华 0
积分 803
帖子 1226
信誉分 100
可用分 7048
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态 离线
2

发表于 2012-9-4 11:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你好，我最近也在做昆虫表达系统，提取Bacmid,转染等等。我直接将Bacmid连同helper,及donor,一起以手工的方法（invitrogen推荐）提取出来，直接用于转染。但是转染失败。我用的转染试剂为lipofectamine 2000。
我想与你探讨的是：
1、bacmid的核酸数量这么大——>13.6Kb,用什么样的抽提方法才能保证在抽提过程中不被机械剪切而发生断裂。
2、请问你是用什么方法来提取Bacmid的？
顶部
www.1[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75147
精华 1
积分 533
帖子 641
信誉分 102
可用分 4121
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
3

发表于 2012-9-4 11:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我用的就是protocal上面推荐的方法一步一步做的，动作已经很轻了，枪头也已经去尖，不知道为什么会出现这种情况这是我的电泳图
顶部
baidukk[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77444
精华 0
积分 803
帖子 1226
信誉分 100
可用分 7048
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态 离线
4

发表于 2012-9-4 11:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

给你看看我提取的Bacmid。或许不如你提取的好。那么请给点意见。
我摇了2ml菌液，存点菌种。剩余的提取效果如下。枪头没有去尖。
你呢，希望能讨论一下细节问题。
0.5%琼脂糖凝胶电泳，117V,12-15min.


查看积分策略说明
附件
2012-9-4 11:10
85155009.jpg (17.87 KB)
 
顶部
yapuyapu[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76072
精华 3
积分 574
帖子 695
信誉分 106
可用分 4338
专家分 30
阅读权限 255
注册 2011-11-1
状态 离线
5

发表于 2012-9-4 11:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

用超纯小抽试剂盒试试，而且bacmid太大电泳不太容易跑，鉴定它比较困难，在昆虫细胞杆装病毒表达系统可采用PCR的办法， 用通用引物M13拉出产物比目的片段大2300bp。
顶部
baidukk[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77444
精华 0
积分 803
帖子 1226
信誉分 100
可用分 7048
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态 离线
6

发表于 2012-9-4 11:12 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

是的，无论用哪种引物，M13通用引物还是片断特异性引物都能看到目标大小的片断。但是，转染就是没有看到细胞病变现象。
所以，怀疑自己的提取Bacmid的手段有问题。
顶部
www.1[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75147
精华 1
积分 533
帖子 641
信誉分 102
可用分 4121
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
7

发表于 2012-9-4 11:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我也是同样的问题啊，谁有抽质粒后的图（转染也成功的）我们看一下？我现在不知道图应该是什么样的。
顶部
baidukk[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77444
精华 0
积分 803
帖子 1226
信誉分 100
可用分 7048
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态 离线
8

发表于 2012-9-4 11:13 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

看来我们找到组织了.呵呵.没有人提出更好的意见之前,我们来讨论讨论吧!我仔细看了你的电泳图谱,而且与我自己的进行比较,发现你最亮的两条带在2000bp左右,而我的则在5000bp左右.我怕怕的想,我们的DH10Bac应该是没有问题的吧?那么可能区别就在于琼脂糖的浓度、电压、电泳时间。0.5%浓度胶，117V，10-15min（肉眼看蓝色条带离开加样孔1-1.5cm）。
顶部
baidukk[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 77444
精华 0
积分 803
帖子 1226
信誉分 100
可用分 7048
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-17
状态 离线
9

发表于 2012-9-4 11:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

你的电泳条件呢？
顶部
www.1[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75147
精华 1
积分 533
帖子 641
信誉分 102
可用分 4121
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-19
状态 离线
10

发表于 2012-9-4 11:14 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我也是同样的问题啊，谁有抽质粒后的图（转染也成功的）我们看一下？我现在不知道图应该是什么样的。
顶部
 12  1/2 12››