[求助]细胞免疫荧光的几个问题

细胞世界 » 讨论区 » 经验共享 » [求助]细胞免疫荧光的几个问题

13 1/2 1 2 ››

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:[求助]细胞免疫荧光的几个问题

bamboo16[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 79663
精华 2
积分 572
帖子 696
信誉分 104
可用分 4391
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-12-14
状态离线

发表于 2012-9-4 11:15 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问:
1:为做一可能在核内表达的抗原的免疫荧光定位,与膜上的比较,除了多加
0.5% TRITON100 外,还有其它什么不同?
2:核内表达的抗原定位是用免疫荧光更好还是用免疫酶标?
3:以下是我做的细胞爬片的免疫荧光(FITC标的二抗),请各位帮忙详细分析及指正:
我的步骤:细胞爬片(约60-70%)___0.01MPBS洗两次_____4%多聚甲醛固定30分钟____PBS振洗5分钟____0.5% TRITON100破膜10分钟___PBS洗___吹干___
1%BSA封闭30分钟____吹干____1比100稀释的一抗___培养箱内2小时(爬片在6孔内)____PBS振洗3次,每次5分钟____吹干____加荧光素标记的二抗(PBS配)____培养箱内1小时_____PBS振洗2次,5分钟____蒸馏水振洗1次____甘油封片.
图1:可能是很强的非特异荧光屏?原因?(我做的是阳性对照啊!!)

附件

2012-9-4 11:15

57622862.jpg (3.55 KB)

bamboo16[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 79663
精华 2
积分 572
帖子 696
信誉分 104
可用分 4391
专家分 20
阅读权限 255
注册 2011-12-14
状态离线

发表于 2012-9-4 11:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

图2:这个图说明了什么啊?这可是我的阳性照啊.

附件

2012-9-4 11:16

32458923.jpg (7.67 KB)

qumm1985[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76908
精华 1
积分 475
帖子 546
信誉分 102
可用分 3616
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-10
状态离线

发表于 2012-9-4 11:16 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1.细胞的密度低了一点，是接种少了还是掉了？

2.第一张片子没有照好，焦距没有调好，所以看不清细胞的结构。
第二张片子只有两个细胞的细胞核是阳性的，而其他的细胞核有的也有阳性的。细胞膜上可以明显的看到一圈绿色的光。

总体判断，实验基本是成功的。只是片子照的不太好。可以调整暴光时间和焦距。我调整了一下对比度，可能效果稍微好点，至少能看清细胞膜上的荧光了。
0

附件

2012-9-4 11:16

41120807.jpg (17.62 KB)

hot_hot_hot[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76450
精华 0
积分 389
帖子 498
信誉分 100
可用分 3247
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态离线

发表于 2012-9-4 11:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

1比100稀释的一抗?
楼主事先做过预试验么？之前的结果如何？

u234[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 77031
精华 0
积分 691
帖子 1081
信誉分 100
可用分 6196
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-12
状态离线

发表于 2012-9-4 11:17 资料个人空间短消息加为好友

小中大

很感.谢
请问:核内表达的抗原定位是用免疫荧光更好还是用免疫酶标?
为做一可能在核内表达的抗原的免疫荧光定位,与膜上的比较,除了多加
0.5% TRITON100 外,还有其它什么不同?

u234[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 77031
精华 0
积分 691
帖子 1081
信誉分 100
可用分 6196
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-12
状态离线

发表于 2012-9-4 11:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的方法有无问题?有的人说我的均是非特异荧光?没什么意义?(真是郁闷!)
请问,你说的只有两个细胞的核有荧光是指那两个最亮的吗?你是否注意到其它细胞中间暗影中心也有少量的绿色荧光?
是否可以说明此抗原在胞浆,胞核均有表达?只是胞浆表达更高此?
对不起,刚做,但老做不好,请多多指教!

u234[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 77031
精华 0
积分 691
帖子 1081
信誉分 100
可用分 6196
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-12
状态离线

发表于 2012-9-4 11:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

另:1比100稀释的一抗是推荐浓度(分装的)

zhenxin[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 76024
精华 0
积分 748
帖子 1216
信誉分 100
可用分 6848
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-31
状态离线

发表于 2012-9-4 11:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

过一段时间我也做了，象大家好好学习

TNT[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 75639
精华 0
积分 455
帖子 610
信誉分 100
可用分 3826
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-26
状态离线

发表于 2012-9-4 11:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

总体感觉象是非特异性的着色。
核内表达的抗原定位是用免疫荧光或者免疫酶标都应该可以。用0.5% TRITON100打孔足够了，建议封闭和打孔和为一步，即在封闭液中添加0.5% TRITON100，37度封闭2小时。加一抗后最好4度孵育过夜（16小时）。

每一步结束为什么要吹干？没有必要吧。
为什么不用DAPI称染细胞核，这样不就看的很清楚了。

zsxan1990[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76272
精华 0
积分 442
帖子 604
信誉分 100
可用分 3776
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-3
状态离线

发表于 2012-9-4 11:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

请问:若用DAPI染,若是在核内表达,两种荧光就会重叠吧?
能否介绍DAPI的配法及用法及价格\公司吗?谢谢!

13 1/2 1 2 ››