[求助]3T3细胞的转染

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标题:[求助]3T3细胞的转染

feima+[使用道具]
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发表于 2012-9-4 12:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

在转染之前已经有人告诫我3T3细胞很难转，我做了两次，转的是EGFP，可是都没有观察到绿色荧光，质粒应该是没有问题的，别人已经做过的，有表达。我用的脂质体Lipofectamine2000. 按照Invitrogen的说明书上说，若用他们提供的Opti-MEM培养液，则 DNA和脂质体共育的时间应该在30min之内；若用DMEM培养液那么 DNA和脂质体共育的时间应该是5min，不知道这有何道理。我用的是DMEM，试了5min和20min，可是都没有转出来。

还请有做过GFP转染3T3细胞的兄弟提供一点建议和成功的体会。

先谢啦！

misswu61[使用道具]
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发表于 2012-9-4 12:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

顺转我做过最好的是30%,36hr后显微镜下肉眼可以观察到很多绿色荧光,用FACS检测应该更多.
我用的也是lipo2000,step 1: opti-MEM 分别和质粒,脂质体室温哺育5min,要轻微flick.step 2: 将上述的质粒和脂质体混合在一起,轻微flick,室温哺育20min.
转染前的细胞最好换下medium,如果感觉血清有干扰,就换成没有血清的,我是从来没有换过,然后用枪把混合液吸到要转染的细胞dish.
大约六小时以后换成正常medium.
24小时应该就有表达,GOOD LUCK!

jujuba[使用道具]
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发表于 2012-9-4 12:50 资料个人空间短消息加为好友

小中大

3T3细胞的转染我已经做过一些尝试，实验结果还不错，似乎并没有所说的那么困难。有些经验可以与你分享：
1、Lipofectamine2000这种阳离子脂质体是一种新型高效转染试剂，对于多数类型的细胞均有效，是否存在血清对其无影响；
2、3T3细胞要保证转染细胞不能老化，传代次数过多时要重新接种原始细胞株，转染前后的培养我一般使用低糖的DMEM培养液；
3、Lipo浓度、DNA浓度或作用时间要达到最佳状态，注意优化反应条件；
4、转染介质中不能存在抑制剂，比如：EDTA、柠檬酸盐、磷酸盐等；
5、Lipo在4度保存，一定不要冷冻；
6、转染时细胞密度要合适，一般铺满瓶底70％－80％；
7、如果不能排除转染过程出现问题，建议你可以通过设立阳性对照进行分析。
我一般室温孵育20min，转染后5h换液。如果实在难以得到理想的转染效率，你还可以试一试其他的转染试剂，比如多聚乙烯亚胺（PEI)，我曾经试过其转染3T3的效率可以达到60％以上。祝你顺利！

缘yuan[使用道具]
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发表于 2012-9-4 12:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

上面的各位师兄：
能不能赠送小妹一瓶正常的3T3细胞呀！
不胜感激！

feima+[使用道具]
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发表于 2012-9-4 12:51 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我的3T3细胞是在中科院上海细胞库买的，500RMB，一般最好自己去买，比较放心，如果细胞不好了，可以找他们换。如果你实在缺MONEY，又对别人的细胞放心的话，告我你的地址，我给你寄一瓶吧。

misswu61[使用道具]
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发表于 2012-9-4 12:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

晕啊,细胞库的细胞多数是有支原体,黑胶虫污染的.

feima+[使用道具]
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发表于 2012-9-4 12:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不会吧，我买的细胞用得挺好的呀，就是很容易变酸，细胞长得太快了，一般传过后两三天就又长满了，如果不及时换液老的培养液就变得黄黄的，细胞马上就大片大片地脱落。而且我感觉细胞贴壁非常的不紧，在转染时稍稍戏一遍就脱落不少。不知道这是什么原因。

二子[使用道具]
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发表于 2012-9-4 12:52 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我刚刚做完一批3T3转染，效果很好，也是用的脂质体Lipofectamine2000。24小时后开始表达荧光，以后荧光持续表达到我做完筛选（大概2周），而且筛选后荧光更多。
以下是我的步骤
1)转染前一天行NIH3T3细胞传代，并以4╳105/(2ml无抗生素DMEM+10%NCS)接种6孔板。
2)第2天待细胞汇合度>90%时行转染。
A.转染前2h，以无血清DMEM洗涤细胞，并孵育2小时。
B.转染：
A)以无血清DMEM将p4COL1A2-EGFP和p4COL1A2-d2EGFP各4.0ug分别稀释至250ul。
B )以无血清DMEM将10ul LipofectamineTM2000稀释至250ul，混匀后静置5min(≤5min)。
C)混合质粒DNA和LipofectamineTM2000，混匀后室温放置20min以便形成DNA-LipofectamineTM2000复合物（可能出现云雾状，但不影响转染效率）。
D)将混合好的500ul的DNA-LipofectamineTM2000复合物分别加入6孔板中的1孔，轻轻摇匀。
C.转染6h后更换10%NCS的DMEM。
3）培养48h后观察荧光，以1：5传代至一次性培养瓶。

3648755[使用道具]
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发表于 2012-9-4 12:53 资料个人空间短消息加为好友

小中大

3T3细胞是有很多种的，NIH3T3是属于比较好转的一种，3T3-L1就比较难转

feima+[使用道具]
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小中大

LipofectamineTM2000的说明书上说，若是用DMEM稀释，则混合质粒DNA和LipofectamineTM2000，混匀后室温放置应该不多于 5min，不知道您是如何理解的，我将质粒DNA和LipofectamineTM2000混合室温孵育5min，做了两次都没有做出来。

上次我用的质粒DNA和LipofectamineTM2000混合室温孵育20min，也做出来了，但是转染效率非常低，只是在某些小块的地方看到发荧光的细胞，恐怕不到10％（附上我所转的照片）。但是我再做了一次质粒DNA和LipofectamineTM2000比例的条件优化，可是几个比例都没有出来，连完全与上次一样的条件的也没出来。现在已经48小时了，可是一个阳性细胞都没看到，真让人崩溃。转染，难道仅凭运气吗？

附件

2012-9-4 12:53

74299606.snap.jpg (9.88 KB)

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