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标题:[求助]如何提取细胞的上清？

star#room[使用道具]
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发表于 2012-9-4 13:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]如何提取细胞的上清？


请教大家，想检测细胞上清中蛋白的活性，当细胞生长至对数生长期时，先用无血清的培养基处理细胞24小时后，再用药物处理，如何提取细胞上清呢？和提取细胞的蛋白有什么区别呢？
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发表于 2012-9-4 13:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

应该和提取细胞总蛋白一样。因为你检测的是细胞中蛋白的活性。
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 小中大

我不是检测细胞中蛋白的活性，检测的是细胞分泌的蛋白的活性，所以要提起上清，还请大家多指教。谢谢!
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 小中大

你可以看看这个:
有兴趣请: applygen@gmail.com

蛋白抽提试剂盒-II (液体样品蛋白抽提和回收，100 extraction)
P1255 100 次提取 280 元
200 次提取 480 元

描述：
蛋白抽提试剂盒-II 用于液体样品中蛋白浓缩、提取、或脱盐、脱去垢剂、脱还原剂等。适用于各种液体样品(10 µl～1000 ml)，如蛋白溶液、胞浆胞核蛋白提取液、细胞或微生物培养基上清液、血液、尿液、脑脊液等各种体液。蛋白回收率95%，远高于经典的丙酮或三氯醋酸沉淀法，且可有效去除样品中的脂质，不影响后续SDS-PAGE和Western Blot实验。可用1.5ml离心管微量提取也可大规模制备，15分钟完成提取，简便高效。

次试剂盒也适于从细胞悬液提取总蛋白。实体组织和细胞总蛋白提取可用蛋白提取试剂盒I (Cat# P1250: Tissue/Cell Protein Extraction Kit)

适用：
(1). 溶液、血液、尿液、脑脊液、培养上清液、胞浆胞核蛋白提取液等各种体液的蛋白浓缩和提取。
(2). 原代或传代细胞悬液，可按液体方式提取总蛋白。

组成：
浓缩抽提试剂50ml。每0.5 ml浓缩试剂可处理100 µl溶液或5 x 106细胞。100次微量或10次大规模浓缩。

储存：
室温
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发表于 2012-9-4 13:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
非常感谢帮助！
我想知道不用试剂盒的方法，毕竟经费有限啊！
还请多指教，谢谢！
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 小中大

细胞裂解液你可以自己配,但蛋白酶抑制剂(一般都用5种)你还是得买呀,而且不一定比买这个盒子便宜.不信你问问那5种蛋白酶抑制剂多少钱?!280够用100次不贵了,老大.
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发表于 2012-9-4 13:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢，这几种蛋白酶抑制剂我们实验室都有，现在我主要想知道提取细胞培养液的上清和提起细胞的蛋白的区别? 谢谢 ！
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发表于 2012-9-4 13:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我想,你提培养液上清,那这个提取试剂至少还有个浓缩的作用吧?还有或脱盐、脱去垢剂、脱还原剂等,提总蛋白的时候只是一点沉淀中加入裂解液.不能一样的对待的.

祝你实验顺利!
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 小中大
请教大家，想检测细胞上清中蛋白的活性，当细胞生长至对数生长期时，先用无血清的培养基处理细胞24小时后，再用药物处理，如何提取细胞上清呢？和提取细胞的蛋白有什么区别呢？

————————————————————————————————————————————————————————————————

第一步,将细胞上清转移到10毫升的试管,离心3000转5分钟,去掉死细胞和杂质
第二步,明确你的待查蛋白含量有多高,从你的说明看来,好象是细胞处理后分泌出来的蛋白.如果高,可以直接取样裂解后,跑WESTERN.如果含量很低,一般都要求浓缩.浓缩方法有很多种.我的实验直接使用MILLIPORE的超滤管(价格,4ml的40元).上面战友提供的试剂盒,价格还是很合理的,就是不知道质量怎么样.如果质量好,我也想试一试.此外还有很多化学浓缩方法,可以搜索蛋白质技术版块.另外,我也没有加蛋白质酶抑制剂,我的蛋白也没有降解.你可以试一试,如果也能测出来,就可以剩掉蛋白质酶抑制剂的钱了.很贵的,我们实验室有用罗式公司的,象药片,很好用.
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 小中大
在药物处理的时候，使用无血清的培养液还是全培养液，是药物溶于培养液中吗？一般作用多长时间？谢谢！
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