细胞世界 » 讨论区 » 经验共享 » [求助]HEK293细胞复苏后觉得不对劲

采购询价

点击提交代表您同意 《用户服务协议》 《隐私政策》

 12  1/2 12››
 
需要登录并加入本群才可以回复和发新贴
打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:[求助]HEK293细胞复苏后觉得不对劲

dongdongqiang[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 79825
精华 1
积分 473
帖子 601
信誉分 102
可用分 3821
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-16
状态 离线
1

发表于 2012-9-8 10:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

[求助]HEK293细胞复苏后觉得不对劲


我冻了一批HEK293细胞,过程如下:
将T25培养瓶中的细胞消化离心后去上清,加入0.9ml的血清(4度),吹打均匀后吸出加入冻存管中,再加入0.1mlDMSO.颠倒混匀后用厚口罩包起来放于-20度冰箱(我们这里没有-80冰箱)过夜,然后移至液氮面上过夜,然后投入液氮中保存.
可是我昨天复苏了一管细胞,刚种到培养瓶里在镜下观察,发现细胞贴壁挺快的,而且细胞的数量也很多.可是今天再去观察的时候发现有很多飘着的细胞,而且贴壁的细胞只有少数几个部分伸展开了.请问这是正常现象吗?大家复苏的时候也是这样子的吗?是不是我的冻存有问题啊?
急死了,请大家帮忙,谢谢!
顶部
xueyouzhang[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76770
精华 0
积分 470
帖子 640
信誉分 100
可用分 3996
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-9
状态 离线
2

发表于 2012-9-8 11:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

说一说我的看法啊，全当交流。
个人感觉冻存的时候直接放到－20度还是过快 ，我们一般都是4度1h，－20度2h然后－80度冰箱过夜然后直接投到液氮罐，你没有超低温冰箱而将细胞放置液氮表面，个人感觉也是可以的。
复苏的时候有没有离心去除dmso你没交代清楚。建议复苏当时即把DMSO离心去掉。
你的细胞特性偶不太清楚，每次传代后多长时间贴壁，既然昨天都发现细胞贴壁了，怎么今天又说贴壁的细胞只有少数几个呢，我对贴壁的标准是细胞有伪足伸开。
顶部
summerxx[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 75852
精华 0
积分 885
帖子 1388
信誉分 101
可用分 7783
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-28
状态 离线
3

发表于 2012-9-8 11:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

-20度时间太长造成细胞活性不佳。DMSO应和血清混好再加入到细胞中，而不是单加。单加DMSO造成局部发热，对细胞也不好。一定要有-70冰箱，否则冻存肯定不好。可以直接将细胞包成棉团后放置于-70冰箱，-20度的可有可无。
顶部
tieshazhang[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74105
精华 0
积分 338
帖子 436
信誉分 100
可用分 2916
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-5
状态 离线
4

发表于 2012-9-8 11:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

肯定不是正常现象，细胞生长状态不好，就像我导师描述的，“半死不活”状态，
我也同意-20度放置时间过长，这么久的时间，细胞处于不能完全去代谢状态，很有可能受到损伤。
另外，DMSO作为保护剂，一定要混合均匀，
还有，是否也考虑了溶解时的情况，必须马上溶解，否则损害比冻存更大。
顶部
HP007[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 74166
精华 0
积分 446
帖子 612
信誉分 100
可用分 3833
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-7
状态 离线
5

发表于 2012-9-8 11:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

DMSO与血清一定要首先混均
顶部
hot_hot_hot[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 76450
精华 0
积分 389
帖子 498
信誉分 100
可用分 3247
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态 离线
6

发表于 2012-9-8 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我的经验是：冻存时不必用全血清，用含30％胎牛血清的DMEM就可以了，配好后每管细胞用0.9ml的30％DMEM＋0.1ml的DMSO，混匀后用其重悬离心的要冻存的细胞。然后4度1小时（此步骤可有可无），-20度2小时，-80度过夜之后进液氮。如果没有-80度冰箱，放至液氮表面过夜再到液氮里也是可以的。但要注意如果液氮很满的话，盖子一盖可能把飘在液氮表面的冻存管给压下去了，等于直接放到液氮里，细胞复苏效果肯定不行。细胞复苏时要注意从液氮里拿出来马上投入37度水浴，而且如果可能的话，复苏时用六孔板复苏，待细胞长满后再传至瓶子里。效果比直接复苏到瓶子里要好。细胞复苏后一般数小时就会贴壁，当然形态完全伸展开要更久一些时间。但如果过夜都没有贴壁、伸展开是不正常的。
顶部
dongdongqiang[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 79825
精华 1
积分 473
帖子 601
信誉分 102
可用分 3821
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-16
状态 离线
7

发表于 2012-9-8 11:02 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢大家的帮助,我说的贴壁就是细胞没有跟着培养基漂着,而是沉到瓶底了.伸展就是细胞把触角都伸开了.感觉细胞刚复苏的时候(5.13)贴壁的挺多,可是第二天去看的时候贴壁的细胞反而少了,今天看发现细胞有很多漂着,贴壁的细胞只有少数伸展开来了,怎么办啊?对了,我的细胞是稳定转染过的单克隆细胞扩增起来的.
顶部
vera+[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 76438
精华 0
积分 506
帖子 711
信誉分 100
可用分 4361
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-5
状态 离线
8

发表于 2012-9-8 11:03 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

以前都是这么冻得吗？

如果不是建议以后冻存可以参考楼上各位的方法。各位都亲自做过，应该可行。版内以前还有很多冻存的经验，可以搜索看看。我记得我以前也写过，和各位大同小异，担复苏都不错。

现在，一个方法是再复苏一管试试（方法一定要正确）。活了，说明你上次没复苏好，那么，你长经验，大家也为你高兴。
如果还是一样，只能是继续养着了，细胞既然是通过克隆长出来的，那么就寄希望于这些少数贴壁的细胞能再慢慢的长出克隆来吧。
顶部
eric930[使用道具]
四级
Rank: 4


UID 79368
精华 0
积分 722
帖子 1061
信誉分 101
可用分 6148
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-10
状态 离线
9

发表于 2012-9-8 11:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
个人感觉冻存的时候直接放到－20度还是过快 ，我们一般都是4度1h，－20度2h然后－80度冰箱过夜然后直接投到液氮罐，你没有超低温冰箱而将细胞放置液氮表面，个人感觉也是可以的。

____________________________________________________________________________________________________________

关于冻存，同意你的意见。
关于不贴壁，我也养过这种细胞，说说我的经历，权当参考吧！
不知楼主的不贴壁细胞是不是看起来还活着？我那时候，一瓶细胞，原来长得好好的，传代一天后贴壁良好，第二天再看，不用显微镜，从孵箱往外拿时肉眼就可以看到细胞滑脱！镜下观察发现细胞状态尚可，滑脱细胞亦大都是活的，后来换了一瓶培养液，解决了这个问题。
后来，一位在协和读博士的老师回来，他说HEK-293对碱性条件特别敏感，培养液成碱性后就会脱落，但细胞仍会存活。
顶部
dongdongqiang[使用道具]
三级
Rank: 3Rank: 3


UID 79825
精华 1
积分 473
帖子 601
信誉分 102
可用分 3821
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-12-16
状态 离线
10

发表于 2012-9-8 11:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢大家!
我只能是先养养看了,实在是舍不得忍掉啊.再复苏一管试一试.
我们的孵箱好象是有一点问题,拿出细胞后二氧化碳回升的挺慢的.而且培养基很容易就变成紫色的(用的是DMEM),是不是因为这样细胞不容易贴壁呢.
再次谢谢大家!
顶部
 12  1/2 12››