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标题:【求助】乳鼠心肌细胞的培养问题

orangecake[使用道具]
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发表于 2012-9-9 15:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】乳鼠心肌细胞的培养问题


最近做心肌细胞培养，怎么都不出结果？不知是何原因？我在园中转了一圈，还是没有找到根源，请各位高手帮忙分析一下，到底哪出问题了？
我取的是出生2天的乳鼠，共12只，剪取心脏,用冷的D-HANKS漂洗两次，转入青霉素小瓶剪成1mm3小粒,然后用0.08%胰酶10ml消化，转速为60r/min,每次10分钟，吹打1分钟，DMEM培养基终止,离心1000转/分，8分钟。共4次就没有组织块了。用100目滤网过滤，收集细胞悬液，计数，加0.1mmol/L5-Brdu,以3×10的5次方接种于24孔板.
8小时后观察发现细胞没有贴壁的,而且象是死细胞,因为悬液里是一些不很透亮的东西,也不是很圆.不知到底是什么?
我又试着用胶原酶消化了一次,结果还是不行.假如说胰酶损伤细胞,那胶原酶应该没有影响啊?可为何还是什么都没有?
我去年冬天也按同样的方法,细胞长的很好,可现在怎么都不行,我所用的试剂是1月份配的,培养基在4度冰箱里,酶在-20度里,都让别的同学试过了,没有问题,可到底是什么原因呢?百思不的其解......我很着急,请各位前辈给予指导!
谢谢了!!
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发表于 2012-9-9 15:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

消耗时候转速太快了，基本上10－20r/min就可以了，我以前也是转速太快，几次就消耗的没有组织块了，但是就是没有细胞。
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发表于 2012-9-9 15:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
不过我看文献上有报道用100转的啊？
以前也是这个转速啊？会不会还有其他的原因啊？你们是一直
用胰酶消化吗？
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发表于 2012-9-9 15:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还有其他问题，如吹打是否太过用力，离心转速600r/min就可以了，离心1－2分钟，中止消化的培养基是否加血清了，取心脏的时间长短，乳鼠是否处死再取心脏，消化时温度控制温度吗？乳鼠最好3－4天的，分离完细胞后，用台盼蓝染色看看。
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发表于 2012-9-9 15:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
你遇到的情况和我刚做实验时差不多，我相你的胰酶浓度低，而且时间作用有点长，造成消化过度，我现在用0.25%的胰酶170－180rpm.5min.不用再吹打，直接吸出来,用含10％FBS的MEM,终止消化，再洗两次就可以预贴壁了，不过心脏剪的不要太小，一个心脏大概分成6－7份就可以，这样是为了让细胞一层一层消化下来，可能时间上花的长一点，但是效果很好
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发表于 2012-9-9 15:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可能的原因：
1.你的试剂一月份配的，放置时间太久了建议重新配。
2.磁力搅拌器转速不可太快否则容易损伤细胞。
3.终止消化时是否加了胎牛血清。
4.8小时后观察贴壁太早了吧，一般心肌细胞要24-48小时才能贴好。
个人意见仅供参考^_^
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发表于 2012-9-9 15:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
还有其他问题，如吹打是否太过用力，离心转速600r/min就可以了，离心1－2分钟，中止消化的培养基是否加血清了，取心脏的时间长短，乳鼠是否处死再取心脏，消化时温度控制温度吗？乳鼠最好3－4天的，分离完细胞后，用台盼蓝染色看看。

————————————————————————————————————————————————————————————————

哦，可能是我吹打太用力了。心肌细胞那么脆弱啊？消化时温度很重要吗？我们的磁力搅拌器没法控制温度。有一次我用烧杯加了水再把含有心肌的锥形瓶放进去，可总是飘，温度也控制不好，结果细胞都死了。用摇床可以吗？摇床可以控制温度和转速，但是不能用搅拌子了啊，我也没有试过，不知是否可行。 离心时间太短没有细胞沉淀啊？有时还有絮状的东西。怎么回事啊？请赐教！谢谢！
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发表于 2012-9-9 15:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

心肌细胞很脆弱，分离步骤尽量要小心，稍微有点剧烈很可能造成细胞死亡。
烧杯里的水可以少放一点，但是要不断补充热水进去，并且吸出一些水，以防水太多，锥形瓶漂起来。最好用个温度计看着水温，一般35－37度，千万别超过37度。摇床我试过，效果很差，因为是空气加热，可能液体升温很慢。
离心时间可以长一些，但是转速最好在1000r/min以下。离心下来的絮状东西，可能是吸液体时把未消化完全的组织吸出来了，这个影响不大，换液就没了。每次吹打完后，静置一分钟左右，这样组织沉下去，吸取上清就不大会把组织吸起来了。吸的时候轻一点。
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orangecake[使用道具]
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 小中大
非常感谢大家，不过我想问一下，胰酶浓度太高了不会损伤细胞吗？你的胰酶是用什么配的啊？如果组织块太大能消化下来吗？你 所说的一个心脏大概分成6－7份是什么意思啊？你通常做几只乳鼠啊？还望赐教！
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 小中大

胰酶一般浓度在0.1%就行了，用PBS配制，可能楼上说的方法 是剪的时候组织块不用剪太小，这样可以提高消化用胰酶的浓度。一般通常每次做10只乳鼠，具体还要根据你细胞的用量定，一次做20－30只的也有。
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