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标题:【讨论帖】骨骼肌卫星细胞培养

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发表于 2012-9-10 12:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【讨论帖】骨骼肌卫星细胞培养

骨骼肌卫星细胞培养互助小组成立了，请支持！
由于课题关系要养骨骼肌卫星细胞.

骨骼肌组织中的成肌细胞主要以骨骼肌卫星细胞的形式出现。骨骼肌卫星细胞是骨骼肌中位于肌细胞膜和基膜之间的具有增殖分化潜力的肌源性细胞，其被激活后，与成肌细胞一样具有增殖分化、融合成肌管、再形成肌细胞的能力。离体培养肌卫星细胞是研究肌细胞生长发育规律、了解肌细胞形态结构变化以及进行肌肉生长发育相关基因功能研究的重要手段。骨骼肌卫星细胞最早从大鼠骨骼肌中分离出来，如今在人、鸡、羊、牛及猪等物种上都已成功分离出骨骼肌卫星细胞，并进行体外培养。

我是采用胶原酶消化法，从肌肉组织中分离骨骼肌卫星细胞。我已经用小鼠试了一下，结果不好。应该是我的技术不过关，而且采取的小鼠骨骼肌样太少了。
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发表于 2012-9-10 12:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我想做骨骼肌卫星细胞培养的肯定还有其他的战友，在此开辟一个小空间，希望大家能构互相交流，互惠互利，一起漂亮顺利的完成试验！
谢谢！！

cuturl('http://www.dxy.cn/bbs/post/view?bid=66&id=2697533&sty=1')
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发表于 2012-9-10 12:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
提供大家一篇好的文章
关于 骨骼肌 卫星细胞的。
需要的战友请跟贴！

Myogenic satellite cells: physiology to molecular biology

J Appl Physiol 91: 534–551, 2001.
THOMAS J. HAWKE1 AND DANIEL J. GARRY
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发表于 2012-9-10 12:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

以下是我个人参照相关文献所做的培养骨骼肌卫星细胞的步骤和经验，仅供参考啊：
SD大鼠，麻醉后在无菌条件下取大腿肌组织，在培养皿内用Hank’s液冲洗血液3－4次，加入适量的青霉素和链霉素预防污染，尽可能去除脂肪、肌腱、肌膜等结缔组织。冲洗后将组织块放入已消毒的青霉素小瓶内，剪成1mm3或更小的碎块，然后移入离心管中，Hank’s液反复吹打3次，每次静置1分钟后，均弃去上清液体及漂浮组织。向组织块中加入0.1％Ⅰ型胶原酶，约组织块的5倍，在37℃下消化60分钟（其间摇晃数次），弃去上清，再用0.25％的胰蛋白酶，37℃下消化30分钟（其间摇晃数次）后，加入生长培养基（DMEM/F12，20％胎牛血清，1％青霉素－链霉素）终止消化，反复吹打，依次滤过100、200和400目的不锈钢网，滤液收集后，离心（1000rpm）10分钟，弃上清，细胞团块用含生长培养基重新悬浮。
红细胞不贴壁，随换液而去除；为减少成纤维细胞的污染，通过差速贴壁法进行纯化：成纤维细胞贴壁速度快，1小时后就可贴壁，而骨骼肌卫星细胞1小时尚未开始贴壁。因此，培养1小时后吸出培养基，其中主要为没有贴壁的骨骼肌卫星细胞。
将悬液接种于培养瓶中，37℃5％CO2孵箱中孵育1小时，弃去培养瓶，细胞经台盼兰染色计数后种植于一次性培养瓶中，37℃5％CO2孵箱中培养。
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发表于 2012-9-10 12:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

由于骨骼肌卫星细胞位于肌纤维的肌膜与基底膜之间,细胞连接紧密,使其能抵抗一般消化酶的作用。胶原酶能够很好地分离单根的肌纤维,起到分离肌束的作用，但不能分离肌束上的卫星细胞，而胰蛋白酶和链霉蛋白酶才能使骨骼肌卫星细胞由基底膜与肌膜之间释放出来。【ROSENBLATT.JD,LUNT.A,ARRY.DJ. satellite cells from living single muscle fibre explants】
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发表于 2012-9-10 12:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

刚分离出来的骨骼肌呈圆形，折光性较强，首次换液可在三天后进行，可见到有梭形或纺锤形的细胞，随培养时间的延长，细胞的生长有一定的方向性，部分区域并可有肌管形成。
另外还可以用组织块法培养，约一周可见组织块周围有梭形的细胞爬出，但只是部分组织块周围有细胞。
给大家提供几篇英文的文章：
1 Development of Approaches to Improve Cell Survival in Myoblast Transfer Therapy
2 Primary Mouse Myoblast Purification, Characterization, and Transplantation for Cell-mediated Gene Therapy
3 Satellite cell proliferation and differentiation during postnatal growth of porcine skeletal muscle
太大了传不上，有需要的pm我
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发表于 2012-9-10 12:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
谢谢 楼上战友提供宝贵的试验经验！
我有一个问题想问一下：我200筛过滤后，接种培养，但是到我换液时培养基里面很混浊，象有一成白沙（或絮状吧）铺在上面，待我第二次换液时还是有，而且我发现细胞浓度很低（我分离了3天了，细胞浓度很低）！
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发表于 2012-9-10 12:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用150目筛网过滤接种培养，培养基里面也是混浊的，显微镜下观察，主要都是一些破碎的肌纤维碎片，一开始我也害怕，还以为是被细菌给污染了呢，不过它们好像不贴壁啊，换液就能去除大部分的。
细胞浓度低可能有一些原因吧：动物的年龄、所取组织块的大小、组织块尽可能的剪碎、消化时酶的用量、消化的时间温度等等，还有与培养液的成分是否有关，许多文献提到了鸡胚提取液，但我一直没有买到，不知道哪里有买的
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 小中大

求助：
我在分离肌卫星细胞时碰到的主要问题：（1）肌肉碎屑太多（2）细胞数量少（3）对肌卫星细胞形态还认识不清（第一次做），与其他杂质、细胞分不清，那位前辈能发几张原代培养未染色图片吗。（4）血细胞怎样清除。
谢谢！
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发表于 2012-9-10 12:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
对啊
希望高手先发几张图片过来！

战友 写道：1）“我用150目筛网过滤接种培养，培养基里面也是混浊的，显微镜下观察，主要都是一些破碎的肌纤维碎片，一开始我也害怕，还以为是被细菌给污染了呢，不过它们好像不贴壁啊，换液就能去除大部分的“”-----可是等我第2次或者第3次换液的时候，里面还是有混浊，即使我换液的时候洗得很干净！
2）“许多文献提到了鸡胚提取液，但我一直没有买到，不知道哪里有买的 ”------------是啊，我也一直没有买到鸡胚提取液，打算自己做，没办法！
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