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标题:【求助】上皮细胞传代不贴壁

mickeylin[使用道具]
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发表于 2012-9-10 16:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】上皮细胞传代不贴壁


我养的是上皮细胞的原代培养. 只是在传代的时候细胞很难消化下来.而且消化下来后, 细胞基本上是不贴壁的了. 我试了很多次, 都不行. 恳请各位指教!!!我要做的免疫组化, 用多聚赖氨酸包被对这个有用吗? 是不是要用胶原什么的包被?谢谢啊!
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hot_hot_hot[使用道具]
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发表于 2012-9-10 16:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
上皮细胞原代培养后传代时，先用PBS洗3次，再用胰酶消化，不要消化时间过长，否则，传代后细胞再不会贴壁生长。如果常温消化很难时，可以放在37度，细胞脱落后尽快加入生长液终止消化。
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dragonkilly[使用道具]
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发表于 2012-9-10 16:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

可以改用进口原装胰酶（水剂，直接用）试试
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mickeylin[使用道具]
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发表于 2012-9-10 16:08 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

非常感谢两位的指点!!请问传代后可以直接种在培养瓶上吗?培养瓶需要包被或者什么处理吗?我传了很多次,没有特殊处理直接种在培养瓶上, 几乎细胞全死了.我做的是原代,很郁闷啊!!
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wu11998866[使用道具]
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发表于 2012-9-10 16:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

不知你在养什么上皮细胞， 我培养的是视网膜色素上皮细胞，比较好长，传代后一般几个小时就大部分贴壁，不用特殊处理培养瓶
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mickeylin[使用道具]
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发表于 2012-9-10 16:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

多谢！那可能是我传代时候消化的方法不对.请问你是怎么消化的?
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lagua123[使用道具]
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发表于 2012-9-10 16:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

以下是个人的体会，希望有所帮助。
待原代细胞生长良好，覆盖培养瓶底2/3以上，培养液颜色变黄时可考虑传代。
1、准备：将培存放于-20度的胰酶取出融解，在开始使用前置于培养箱中预热；培养基温度亦不宜太低。
2、弃去旧培养液，用PBS洗两遍，用吸管吸干残液后加入胰酶（含EDTA），用量只需覆盖瓶底即可，置于培养箱2-3分钟。取出后一边在镜下观察，一边水平晃动瓶身，观察到大部分细胞收缩变圆，悬浮起来呈流沙状运动即可。立即加入少量含胎牛的培养基终止消化，用吸管在培养瓶内有顺序地轻轻吹打瓶底，防止气泡产生过多。
3、吸出于离心管内，1000r/min离心10-12min，弃去液体，加入培养基反复吹打，使细胞悬浮均匀，以1：3接种于3 个培养瓶内。如果原培养瓶消化较彻底则可重复利用。
4、一般隔夜后次日观察即可发现细胞已大部分贴壁了，3-4天就可再次传代。
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发表于 2012-9-10 16:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

非常感谢大家的热心支持!!!我们实验室有人的细胞消化后可以呈流沙状运动的,但是我的细胞从来没有试过那样. 好像消化的很艰难一样, 有一部分细胞变圆的,但是有一部分细胞还贴的很紧.这种情况该怎么办? 继续消化怕过度, 不再消化又有一部分, 大约有一半, 没有消化下来.

另外一个是,你的离心是用10-12分钟吗? 我只是用5分钟,不知道这有没有什么影响呢?
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dongdongqiang[使用道具]
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发表于 2012-9-10 16:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

加胰酶(0.125% with EDTA)前用生理盐水洗一次（残余的培养基里的血清会中和胰酶，使细胞很难消化下来）。注意消化液一定要完全覆盖培养皿底部的细胞。 5分钟之内（37度），细胞应该会完全被消化下来。用手敲敲培养皿的壁可以帮助细胞脱离。用显微镜检查一下。离心5分钟足够了（1000 rpm)。
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S6044[使用道具]
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发表于 2012-9-10 16:11 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一般来说上皮细胞的原代培养是比较麻烦，而且只能传两代或者三代，一般我们实验都用第二代，因为即使传到第三代，细胞也不是很好了。我们一般用0.05％Trypsin－0.02％EDTA消化（进口试剂盒），含血清培养液中和，37度消化10分钟左右，离心是1000转10分钟，还有传代的细胞推荐用一次性的塑料培养瓶，因为瓶底经过特殊处理利于细胞贴壁，最好不要用重复利用的玻璃瓶，角质细胞很难贴壁。
还有细胞呈流沙状，如果是运动的大部分是细菌污染，如果不动基本是死亡的细胞碎片，建议丢弃，还有细胞传代后如果可以存活一般两天内可以变形并形成小的克隆，如果超过5天虽然有贴壁但仍然是圆形的，不变形增殖那么就不要在留在培养箱里了。
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