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标题:【求助】荧光素酶活性测定？

gogo[使用道具]
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发表于 2012-9-10 16:48 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】荧光素酶活性测定？


质粒转染细胞后，测定荧光素酶活性时，蛋白是否需要进行定量？我看一些文献只是取裂解液上清10或20ul，并没有进行定量，这对实验结果没有影响吗？谢谢！
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mickeylin[使用道具]
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发表于 2012-9-10 16:49 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我一直在做这方面的工作，就是把构建的一个质粒接到pGL3-basic载体里，通过瞬时或稳定转染细胞，加药一定时间后，通过测定荧光素酶的活性的变化就可以间接反映药物对构建的质粒所行使功能的影响。
裂解细胞后（96孔板，每孔加20ul裂解液），37度裂解约20分钟后，把裂解液混匀并转移至不透光的白板。每孔加70-100ul Luciferase Assay Reagent ，然后快速检测其发光。
细胞荧光素酶表达活性的测定采用荧光检测试剂盒 Luciferase Assay System。原理是细胞表达的荧光素酶分子能通过电子转移使底物荧光素酶氧化为氧化荧光素，同时发光，光强与荧光素酶分子至少1-8倍范围内呈线性关系，在1分钟内保持恒定，5分钟后开始明显衰减。荧光读书可由BMG Polarster Galaxy y荧光台式培养板用分光光度计测量。荧光素酶活性是用与光吸收量相关的数字来代表的。
荧光检测试剂盒采用Promega 的 Luciferase Assay System，我在附件里把该试剂盒的详细说明书发给你，包括原理具体操作什么的都有，但愿对你有所帮助。
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gogo[使用道具]
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发表于 2012-9-10 16:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我用的是Promega的E1500，protocol我也看了。我就是像请教一下不对蛋白定量对结果影响有都大？是否应该是蛋白量相同而不是蛋白体积一致才合理些?
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TAT[使用道具]
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发表于 2012-9-10 16:59 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

原则上是应该保证测试体系中的总蛋白量一致，不过我在实验中发现蛋白定量后的测试结果趋势和SD要比不定量的结果差很多。尤其在转染3t3等铺展较开的细胞时，往往测出的蛋白量有的样品是负值，所以没法进行normalize。
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gogo[使用道具]
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发表于 2012-9-10 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

如果这样的话，我们很难下结论的。我目前正在做，而且是单荧光的那种，唉真的不知道是否应该钻这个牛角尖？
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2541[使用道具]
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发表于 2012-9-10 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

看你干什么用的，同时有没有平行对照。
我们做的是不需要定量的。但我也见过另外的实验，是需要定量的。
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gogo[使用道具]
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发表于 2012-9-10 17:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是想检测某一蛋白是否对NF-κB 激活转录活性有调节作用？

实验材料：PGL3control ， pmcv-κB-Luc 及目的基因重组质粒，如果说对照便是真核空载体与， pmcv-κB-Luc 的共转染。

不知如何设计实验可以尽量减少误差？请指点迷津！
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dragonkilly[使用道具]
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发表于 2012-9-10 17:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

只要在转染过程中共转染 internal control 用的质粒，可以是beta-gal,也可以是另一种荧光素酶的质粒，将结果做一下相除，内参的做用就是标准化蛋白含量不同和转染效率不同的。所以理论上讲不需要上相同量的蛋白。
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gogo[使用道具]
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发表于 2012-9-10 17:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
只要在转染过程中共转染 internal control 用的质粒，可以是beta-gal,也可以是另一种荧光素酶的质粒，将结果做一下相除，内参的做用就是标准化蛋白含量不同和转染效率不同的。所以理论上讲不需要上相同量的蛋白

那是双荧光，可如果是单荧光呢？
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yychen[使用道具]
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 小中大

You have to use internal control in any case in that luciferase is quite sensitive, without internal control, nothing you can conclude even you load same amount protein.
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