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标题:【求助】淋巴细胞分离问题

feima+[使用道具]
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发表于 2012-9-10 17:04 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】淋巴细胞分离问题


昨天做了淋巴细胞分离，方法是：静脉血肝素抗凝，PBS 1:1稀释，3 ml分离液上加6 ml 稀释血液，液面分界清楚。2000 rpm，室温，20 min。离心后分层界面清楚。吸取中间PBMC层，PBS稀释后再离心，2000 rpm, 10min，但无淋巴细胞沉淀，镜下观察有很多悬浮细胞。
这会是什么原因？请赐教。谢谢！
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gmjghh[使用道具]
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发表于 2012-9-10 17:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1。PBS稀释后是否混匀后再离心。
2。可能吸取中间PBMC层是带入了过多的分离液，PBS稀释的量较少，导致溶液比重过高，细胞悬浮。
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zranqi_1[使用道具]
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发表于 2012-9-10 17:05 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我是将中间层全吸出来了，问题可能就出在这里？淋巴细胞只是在分离液和稀释血浆交界处吗？还有，我是用来分离单核细胞的，昨天看见一个帖子说这样分离出的淋巴细胞中无单核细胞，是这样吗？再次感谢。
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dragonkilly[使用道具]
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发表于 2012-9-10 17:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

淋巴细胞只是在分离液和稀释血浆交界处，也就是分离液的上界面。
单核细胞和淋巴细胞是混在一起的，但主要是淋巴细胞，单核细胞仅占很少部分。
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园丁##[使用道具]
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发表于 2012-9-10 17:06 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
淋巴细胞分离做的多了，也积累了 一点经验和教训，谈谈我的想法。我不明白您为什么要PBS稀释，我觉得没必要。肝素抗凝后可以直接分离。还有，您分离中我发现是标本多分离液少，我觉得正好反了，淋巴细胞分离最好标本量≤分离液的量。2000r离心时间10分钟足够了，dongwp战友说的很对，如果吸出过多分离液，相对要多加PBS，混匀后二次离心，其实没有必要吸那么多分离液，离心后，中间层可见明显的灰白色的淋巴细胞层，只把它吸出来就可以了。淋巴细胞分离的方法操作并不是那么严格，每个人的操作条件可能不一样，达到目的就可以了。
这种分离方法，不可能把单核细胞和淋巴细胞分离开 的。
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feima+[使用道具]
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发表于 2012-9-10 17:07 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

谢谢各位！因为是第一次分离，没有任何经验，我们这里也没人做过，于是就在园子里看了一些帖子，依样画葫芦做了起来。至于用PBS稀释血液及淋分液与稀释血液比例，也是看了别人的成功做法而定的，说明这种方法应该是可行的吧？所以这次失败的主要原因还在于离心后吸取的中间层太多，而后加入PBS又太少，以至于液体密度太大，离心后细胞难以沉淀。再次感谢大家的热心相助！
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qumm1985[使用道具]
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发表于 2012-9-10 17:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

其实啊，我们加PBS是原因的。

在我们实验中，是要收集血浆来做其他实验的，因此剩下的血就边粘稠了，不好提淋巴细胞，因此要加PBS来还原到它原来的状态。

还有一种情况就是收集到的全血 本身就很粘稠，血浆很少。这样也需要加PBS来稀释。

我们一般用生理盐水来稀释。
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fklo83[使用道具]
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发表于 2012-9-10 17:09 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

有没有用淋巴细胞做微核试验的?怎样才能观察微核？
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发表于 2012-9-10 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

我觉得是你吧下层的分离液吸上来了！！
所以很难离心去掉了
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dragonkilly[使用道具]
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发表于 2012-9-10 17:10 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
吸取中间PBMC层，PBS稀释后再离心，2000 rpm, 10min，但无淋巴细胞沉淀，镜下观察有很多悬浮细胞。
这会是什么原因？请赐教。谢谢！

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原因楼上也有人解释了，主要就是你吸取分离液（位于红细胞沉淀与云雾层之间）

我想说的是，你吸出PBMC后，用2000rpm 10min有两个问题值得注意：
1、转速太高
2、时间太长
　
这两个问题都会影响细胞的活性，细胞很容易成团，死亡。
我的经验：吸取PBMC后，洗涤最好用培养液或PBS加入BSA以保证细胞在洗涤过程中也有营养。，另外，离心可用1000rpm,3min。

我都是这样做的。
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