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标题:【求助】两步法流式抗体标记不上，急！

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发表于 2012-9-14 13:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】两步法流式抗体标记不上，急！


我用的一抗是ebioscience的HLA-A,B,C，1：50～1：200稀释，4度孵育30分钟～2小时都试过；二抗是FITC标记的goat anti-mouse IgG(h+l)，1：100，1：200稀释，4度孵育45分钟。标记卵巢癌细胞，试了好多次，都标不上，急死了。会是抗体的问题吗？这两个公司的抗体可以信赖吗？
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发表于 2012-9-14 13:53 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

1 感觉上如果是进口抗体，抗体本身的问题应该不大。
2 一抗标记为什么是4度，如果一定是4度的话，应该试一下标记过夜。否则37度。
由于一抗也没写清楚动物来源和性质。也不知道是否与二抗能相合。
3 该抗原组织是否需要进行修复？
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发表于 2012-9-14 13:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

一抗是mouse anti human的，二抗是goat anti mouse
用4度45分钟左右是查文献看到的，最多也就是4度1小时，没有过夜的说法。是流式啊。
什么是修复？
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发表于 2012-9-14 13:54 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

对标记的二抗进行操作的时候需要很严格的避光吗？我只保证了孵育和离心避光及4度，操作时保证不了。会有影响吗？
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发表于 2012-9-14 13:55 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

HLA 是具有多态性的，也许你选用的HLA 抗体与标本不匹配，或是你的标本的HLA表达下调。最好参照文献做。FITC二抗不必严格避光，我平时只是注意不要暴露与强光下过长时间的。
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发表于 2012-9-14 13:56 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
同意楼上战友说法，一抗的孵育温度可以适当提高，不是每种抗体都是在4度下标记，因此可以适当提高在室温或37度下孵育半个小时以上试试。标记荧光抗体时避光是应该的，即使荧光并非见光就淬灭，至少还没有做出结果时要按照要求做。在操作时把日光灯关掉，只要能不妨碍操作就可以了。

还有 ，我想说的就是，干吗不用ebioscience的一步法试剂FITC anti-human HLA-ABC做呢？他们有现成的一步法做流式试剂，我也用他们公司的做过.虽然从理论上讲，二步法具有放大效应，检测更敏感，但我觉得，一步法方便，特异性强，中间环节少，操作简单，效果也很好么。


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发表于 2012-9-14 13:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
下次就该用直标法吧！


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发表于 2012-9-14 13:57 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

查到的文献用的都是两步法，虽然我不知道是为什么，但是第一次做吗，还是严格按文献来。我是这么想的。我做完以上两步后又用5ug/ml的PI染了一下，以分选活细胞。但是用了PI就不能固定了，有这种说法吗？
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发表于 2012-9-14 13:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

而且不是说4度孵育可以减少表面分子的内化和脱落吗？
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发表于 2012-9-14 13:58 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

那么肯定不是抗体的问题吗？
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