【求助】瞬时转染293T，LIPOFECTAMIN2000效率...

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标题:【求助】瞬时转染293T，LIPOFECTAMIN2000效率...

vcve[使用道具]
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发表于 2012-9-15 14:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我想瞬时转染293T细胞，做WESTERN，不知道lipofectamine2000效率高，还是Ca（PO4）3转的高？
有哪位大侠有经验？谢谢

misswu61[使用道具]
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发表于 2012-9-15 14:00 资料个人空间短消息加为好友

小中大

在细胞系中，293细胞是很好转染的一种，我们用lipofectamine2000转过，效率很高，而且条件很容易掌握；而用磷酸钙的话，转染效率虽然也很好，但是条件很难掌握的，特别是PH值，是直接影响DNA-磷酸钙复合物形成的因素。所以建议你如果有现成的lipofectamine2000，就用它了。

vcve[使用道具]
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发表于 2012-9-15 14:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

还想问一下，你用LIPOFECTAMINE2000转293T细胞，用几孔板转的，DNA和LIPOFECTAMINE是什么比例？谢谢。

HP007[使用道具]
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发表于 2012-9-15 14:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也用过LIPOFECTAMIN2000转染293细胞，效果很好，我转染的六孔板，每个孔1ugDNA，DNA和LIPOFECTAMIN2000比例是1ugDNA:2ulLIPOFECTAMIN2000，希望你能成功

xingyi08[使用道具]
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发表于 2012-9-15 14:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我想问问，按照LIPOFECTAMIN2000说明书上，六孔板应该加入10ul，怎么加了2ul就行呢？不太明白，能解释么？谢谢！

zsxan1990[使用道具]
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发表于 2012-9-15 14:01 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我转的每个孔1ugDNA，你也可以转的量大一点，比例就是1ugDNA:2ulLIPOFECTAMIN2000，可以做一个梯度，比如0.5ug,1ug,2ug,3ugDNA等，我做的结果是转的量太大了对细胞毒性大，所以选择了转1ugDNA

vcve[使用道具]
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发表于 2012-9-15 14:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

然后你做WESTERN了吗？成功了吗？我想做这个瞬时转染就是想做WESTERN，可总担心6孔里转的细胞不够做的，6孔里的细胞转完后，你是直接加LOADING BUFFER把293细胞吹下来的吗？加多少ul合适？全部上样吗？谢谢
问题好象就是没完没了了。呵呵。

owanaka[使用道具]
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发表于 2012-9-15 14:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

６孔板一个孔的细胞用来做Ｗestern足够了，你可以先把细胞裂解液约１００ul加入细胞表面，室温作用１５分钟，吹打后转入离心管，注意不要吹起气泡．离心后取上清，进行定量，然后加入上样缓冲液沸水中煮５分钟后转入冰浴，即可上样电泳．

S6044[使用道具]
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发表于 2012-9-15 14:02 资料个人空间短消息加为好友

小中大

对于2楼的说法，本人持保留意见。我曾经用LIPO2000转染293t，效率也很高的，但是他的细胞毒性却是不可避免的。而磷酸钙转染对于293t细胞来说，简直如同催化剂一样，转染效率奇高，我按照2、3版分子克隆上的方法都是如此，而且他又一个任何方法都不能比拟的优点，就是很便宜，除了有点浪费质粒。附上我做的磷酸钙转染图片，绿色的为转染后表达的pegfp,仅供参考。

附件

2012-9-15 14:03

53357239.jpg (40.04 KB)

youyou99[使用道具]
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发表于 2012-9-15 14:04 资料个人空间短消息加为好友

小中大

用用LIPOFECTAMINE2000转染时，DNA和LIPOFECTAMINE的比例就按照其protocol上面的比例先做，通常都是很好的，如果觉得转染效率不高的话，可以改变细胞接种密度，DNA和LIPOFECTAMINE的比例等条件，Good Luck！

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