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标题:【求助】怎样看精子彗星实验的结果(PP多多)

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【求助】怎样看精子彗星实验的结果(PP多多)


我做精子彗星实验快一个月了,反复改变实验条件做,连阳性对照都不能见到典型的彗星拖尾现象,看得越多,连是否有拖尾都不能肯定。在此请各位高手帮我看看,究竟有没拖尾,为什么不能出现典型拖尾现象。阳性对照我是采用200mM的高锰酸钾处理10min以上。
基本实验步骤:
1.铺胶、冷却。
2.裂解60min。
3.碱性液中(PH大于13)变性20~40min。
4.碱性电泳:1V/cm,100mA,60min。或者1V/cm,300mA,10min。
5.EB染色观察。

图一未经裂解变性电泳,直接染色的精子


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图二、同样方法处理体细胞,电泳1V/cm,300mA,30min,可能时间稍久了一点,但基本可以看出来能作出拖尾现象的。


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图三同样方法处理体细胞


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图四精子作出来就看不出来什么东西了


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图五有些精子似乎有点拖尾,但还是不敢确定,不明显。非要在油镜下看吗?


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图六.有拖尾吗?
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图七.再来一张


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图八看看这张


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图九.还有很多


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图2,3可以看出来是有拖尾的,其它都不明显。
我想说五点:
1.要判定拖尾情况,首先要拍到比较清晰的相片,所以要选择合适的放大倍率,比如图2或图3的放大倍率是合适的;
2.阳性对照我们一般都是用过氧化氢来做的;
3.电泳时间10min显得短了。电泳时间的原则是:DNA损伤中等或是较重,一般电泳20-30min左右;如果DNA损伤较轻,电泳的时间要适当延长;
4.我们拍到的背景色一般是黑色的,你怎么是墨绿色?背景有较多的杂质,主要是由于胶铺的过薄的原因,不知道你铺的两层还是三层?
5.图1可能是作的control吧;但是一般con我们都是跟处理组一样做的comet assay;而不是不经裂解,直接染色。
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