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标题:【求助】昆虫细胞sf9转染总失败,请高手指教

ero11[使用道具]
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【求助】昆虫细胞sf9转染总失败,请高手指教


我近来在做昆虫细胞sf9的转染,载体是invitrogen的pFastBac1加上我的目的基因,由于我是刚开始做,为了使细胞在六孔板贴的更牢固,我都是提前一天种板,第二天早上做转染,步骤是按invitrogen提供的操作步骤,请教作过昆虫细胞转染的高手,在实验中是否还需要注意什么事项?我的转染培养基不是sf99-II SFM,而是用实验室现有的培养基IPL-41和Grace两种液体培养基会有问题吗?但转染一直不成功。非常感谢各位,给出出主意,谢谢了!
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ero11[使用道具]
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没有说明白,是该载体转座到DH10Bac大肠杆菌后,提取的重组杆粒转染细胞。
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baidukk[使用道具]
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请问你用invitrogen的哪种钻入试剂?是cellfectin吗?
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zhezhe[使用道具]
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转染时是不加血清的,同时细胞状态要很好。
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是cellfectin,我的具体操作是:提前一天用有血清的Grace全培养基种板,每孔2ml,第二天用无血清的洗板,并用2ml放置1h,中间配溶液A和B,100ul培养基分别加1ug重组杆粒或6ul cellfectin,混合A和B室温孵育30min左右,加800ul培养基,转染时的培养基是无血清的,在28度培养箱放置4-5h,换2ml有血清的Grace全培养基,随后几天观察。帮我看看该过程是否都正确,你们的操作步骤是这样吗?还需要注意哪些?谢谢!
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3648755[使用道具]
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在加800ul培养基后,少写了一步:吸去板中的无血清培养基,将上述混合约1ml的溶液,加入板中,放入培养箱4-5h进行转染,在换2ml有血清的全培养基。
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owanaka[使用道具]
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转染步骤:
1.用Grace培养基(不含抗生素和FBS)吹打细胞,把大约9×105个细胞放置于六孔板,Grace培养基体积约2ml,此时使用的细胞应该是培养了3~4天处于半对数生长期,成活率大于97%。
2.允许细胞贴壁至少1小时。
3.在1.5ml灭菌eppendorf管准备下列溶液:
a)溶液A:每次转染,把5μl 重组Bacmid加到100μl的Grace培养基,混匀。
b)溶液B:每次转染,把6μl CellFECTIN Reagent加到100μl的Grace培养基,混匀。CellFECTIN Reagent是脂溶性的混悬液,放置时间久可能出现沉淀,因此每次用之前要振摇几次,保证取样的均一性。
4.溶液A和溶液B混合,在室温孵育15~45分钟。
5.向溶液A和溶液B混合物加入Grace培养基0.8ml,混匀;吸去六孔板中Grace培养基,加入溶液A和溶液B混合物。
6.27℃孵育5小时。
7.去掉转染混合物,加入昆虫细胞培养基,密切注意细胞的形态变化。
8.转染72小时后收集病毒。
多多交流!
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这是昆虫细胞转染的标准操作,请教:Grace培养基是指不含血清的全培养基吗?因为Grace有粉状的还有液体的,液体的只要加FBS就行,粉状的还有加许多别的东东,再用ddH2O配,你用的Grace是从公司直接买的液体培养基吗?
总体感觉让细胞贴壁1h,不会很牢,换液就会掉下来,所以我试着用提前一天种板的细胞,这样会影响后来的实验吗?
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昆虫细胞表达重组蛋白建议使用的是无血清培养基,有血清的培养基会对实验有何影响?
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tuuu2[使用道具]
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提前一天种,没有问题的。我们经常这样做。
不过你怎么知道你转染失败了,是做滴度吗
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