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转染步骤:
1.用Grace培养基(不含抗生素和FBS)吹打细胞,把大约9×105个细胞放置于六孔板,Grace培养基体积约2ml,此时使用的细胞应该是培养了3~4天处于半对数生长期,成活率大于97%。
2.允许细胞贴壁至少1小时。
3.在1.5ml灭菌eppendorf管准备下列溶液:
a)溶液A:每次转染,把5μl 重组Bacmid加到100μl的Grace培养基,混匀。
b)溶液B:每次转染,把6μl CellFECTIN Reagent加到100μl的Grace培养基,混匀。CellFECTIN Reagent是脂溶性的混悬液,放置时间久可能出现沉淀,因此每次用之前要振摇几次,保证取样的均一性。
4.溶液A和溶液B混合,在室温孵育15~45分钟。
5.向溶液A和溶液B混合物加入Grace培养基0.8ml,混匀;吸去六孔板中Grace培养基,加入溶液A和溶液B混合物。
6.27℃孵育5小时。
7.去掉转染混合物,加入昆虫细胞培养基,密切注意细胞的形态变化。
8.转染72小时后收集病毒。
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