【求助】求助

细胞世界 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】求助

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】求助

avi317[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 74131
精华 0
积分 566
帖子 811
信誉分 100
可用分 4896
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-6
状态离线

发表于 2012-9-16 09:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

本人最近分离人外周血单核细胞培养,用的是TBD和鼎国产淋分液,操作按说明书,离心2000RPM20min,后发现血浆层呈淡红色,使得淋巴细胞层与上中层界限不清,无法取单核细胞,我试着把转速调低未果.我去年也分过淋巴细胞当时一点问题也没有,同样的条件和操作为何本次会出这种问题?请高手救命呀!!

qqq111[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 73201
精华 0
积分 830
帖子 1238
信誉分 101
可用分 7086
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-20
状态离线

发表于 2012-9-16 09:35 资料个人空间短消息加为好友

小中大

从你的描述看，可能确实有溶血现象，一般来说，新的淋巴细胞分离液应该没有什么质量问题的，除非时间太长或其他原因导致失效。你的血源是要求某种疾病患者还是健康者的呢？在一些疾病患者（比如某些肿瘤患者）血细胞脆性增加容易导致有溶血现象，因此如果有类似患者的，你可以同时分离健康者的血液淋巴细胞看看。还有，你每次采完血液标本后尽早分离，如果来不及先放置在4度冰箱，不要放在室温下。一般的说明书上要求全血等体积稀释，按说没什么问题的，我有时分离时就是全血直接加在分离液
上也可以，你也可以试试，反正在摸索嘛！

kulee[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 77361
精华 0
积分 615
帖子 849
信誉分 100
可用分 5127
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-16
状态离线

发表于 2012-9-16 09:36 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我也作淋巴细胞分离，也是把静脉血直接加在淋巴细胞分离液上，只有一次，因为血液冻成冰了，再溶后，产生了与你相识的结果，你的是不是与温度有关！

avi317[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 74131
精华 0
积分 566
帖子 811
信誉分 100
可用分 4896
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-6
状态离线

发表于 2012-9-16 09:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我抽的是自己的和实验室里人的血，应该没问题。初次发贴不懂规矩，斑竹能不能让我这个帖子在这里放几天，我现在急需高手指点，谢谢

ffooll[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 73418
精华 0
积分 437
帖子 574
信誉分 100
可用分 3666
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-22
状态离线

发表于 2012-9-16 09:37 资料个人空间短消息加为好友

小中大

会不会分离液或稀释缓冲液的渗透压及pH有问题？我们知道蒸馏水(属于低渗)可以裂解红细胞。按正常离心速度和时间，分离界面不清楚可能是淋巴细胞分离液的比重不再是工作范围了。
建议你重新配稀释缓冲液并用新的淋巴细胞分离液分离!我想问题就可以解决的。我用的是上海产的淋巴细胞分离液，效果还挺好的。

qumm1985[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76908
精华 1
积分 475
帖子 546
信誉分 102
可用分 3616
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-10
状态离线

发表于 2012-9-16 09:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

如果条件允许，用电无血清的DMEM试一试

avi317[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 74131
精华 0
积分 566
帖子 811
信誉分 100
可用分 4896
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-6
状态离线

发表于 2012-9-16 09:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我用的是自己配的无菌滤膜过滤过的D-HANK’S液（PH值在7.2左右）等体积稀释全血，再将稀释血按1：1比例加到淋分液里，难道是渗透压不对？不大可能呀

tieshazhang[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 74105
精华 0
积分 338
帖子 436
信誉分 100
可用分 2916
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-5
状态离线

发表于 2012-9-16 09:38 资料个人空间短消息加为好友

小中大

稀释血与淋巴细胞分离液的比例是2:1,此外用鼎国的分离液离心时间不宜太长,5分钟就足够了,淋巴细胞分离液事先需在37度水浴箱加热再用,照我说的先试试吧.

IAM007[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 75217
精华 0
积分 464
帖子 608
信誉分 100
可用分 3861
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-20
状态离线

发表于 2012-9-16 09:39 资料个人空间短消息加为好友

小中大

5分钟就行了吗？我第一次听到此种方案，请问能否完全分离好，您获得的细胞数每ml多少，如果可能请告知,谢谢！

mamamiya[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 72974
精华 0
积分 653
帖子 986
信誉分 100
可用分 5763
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-9-16
状态离线

发表于 2012-9-16 09:43 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我从来没做过5分钟，感觉可能这样分离可能不够彻底吧，我每次实验血源来的不容易，未曾做过5分钟。你可以试试。
2000rpm,离心20min,云雾层吸的较彻底的话，一般可以每ml血可以得到1~2*10^6个细胞，当然里面含有淋巴细胞与单核细胞。
换个上海产的淋巴细胞分离液，不是很贵的。稀释液不妨再配一次，这也不是很大的问题。如果这样，我想问题应该会解决的。