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标题:【求助】从大鼠胸主动脉取平滑肌细胞如何操作?

wood533[使用道具]
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1
 

【求助】从大鼠胸主动脉取平滑肌细胞如何操作?

按贴块法操作,如何把大鼠的中膜撕下,忘做过的多指点!
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redbutterfly[使用道具]
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2
 
不知阁下做过兔子的平滑肌否,兔子的主动脉较大,去中膜还算简单。
大鼠的主动脉用贴块法在肉眼下有一定难度,可以试着在解剖镜下操作。先将主动脉沿纵轴剪开,去除周围结缔组织后,在解剖镜下仔细剥离,一定要剥离干净,然后就可安心等待细胞爬出来了。
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wood533[使用道具]
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3
 
我就是无法把握剥离干净这个度!

我救没看见有中膜外膜内膜,最多好像就是把血管剥成白色!

能否说说如何把握这个度!

万分感谢
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wood533[使用道具]
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还有两个问题
1.据说100ml的玻璃瓶需要6-8个大鼠的动脉脉,是否需要这么多??

2.平滑肌细胞是否用玻璃培养瓶救行了!
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yychen[使用道具]
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5
 
我做大鼠主动脉平滑肌细胞培养时这样的:
1、去除外膜时是用一眼科弯镊夹住一端,另外一个镊子在动脉表面机械划拨(不知道怎么形容更贴切),再处理另外一端。
2、去除内膜,是用眼科剪纵向剪开动脉,用棉签在血管内面捻掉内皮(还是不知道怎么形容这个动作更好)。
3、至于掌握的度,不好说的,也是成为白色,在去外、内膜时尽力些,宁肯多划、多捻。
4、每次原代培养所需的大鼠,100ml培养瓶我一般用6只,少点也可以的,但是多点大鼠,原代细胞可以很快就长满瓶底的,不用等太久就能传代了。
5、我用的是玻璃培养瓶养的VSMC,如果进一步实验用于药物刺激提取RNA、蛋白,就传代到培养皿里,当然一次性进口塑料皿里细胞的确长得好些。
仅供参考,不足请指教!  
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yychen[使用道具]
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另外,请问,你有没有养过成年大鼠的心肌细胞? 我要养,好象也很难。
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duoduo[使用道具]
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7
 
实在是非常感谢,在下还有几个问题要请教:
1.为什么说要尽量多捻以去出 除干净内膜和外膜,是否如果不清除干净会影响平滑肌细胞从组织块长出,还是会印象平滑肌细胞的纯度?
2.我在操作过程中血管可以迅速剥离成白色,但是随后的剪成1平方毫米的组织块觉得很有难度,特别滑溜,使不上劲,而且最后也不是规则的正方形小组织块。请问你操作中是否每块组织块都能达到1平方毫米这么小的要求?
3.组织块贴壁的问题:我用的是50平方毫米的培养瓶,用移液枪伸入培养瓶把揉在一起的组织块展开,烘干再翻转培养瓶。请问把组织块展开这一步是否也很重要。
4.还有就是一般要多长时间细胞会长出,我怀疑我操作中的组织块没有达到1平方毫米以下的要求,(我的最大估计有2平方毫米多),另一个存在的问题我估计是组织块没有很好的贴在瓶上,你在操作中能否达到当培养液浸泡了组织块后,组织块还是都贴在瓶壁上,在下实在不好意思,有一些漂浮起来了。

最后非常抱歉我的课题一般不需要养心肌细胞,不过过段时间要养冠脉内皮细胞,据说这个特难养,不知道你养不养的。

都说平滑肌细胞特容易养,这个是否属实?
本人组织培养2天了,今天忍不住看了看好像没见到一个细胞的影子,实在是郁闷!
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wood533[使用道具]
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8
 
两位都特强调剥离内膜和外膜干净,是否没有剥离干净,平滑肌细胞就很难从组织块游出来??
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yychen[使用道具]
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9
 
抱歉,我疏忽了,当时我做使用的是酶消化法。现在我们实验室技术员在用贴壁法培养,我请教过她:
1、去除外膜和内膜的方法二者是一样的。我觉得不去除干净主要影响的是细胞的纯度。
2、剪动脉时是不容易剪碎,一定要用锋利的眼科剪,如果剪刀钝会加重组织的损伤,可能会影响细胞的活力。组织块的大小并不都是1平方毫米的正方形,多为不规则的,1-2平方毫米,甚至大于2平方毫米。
3、组织块贴壁:把组织块均匀的分布在培养瓶底,并展开很重要的。没有用烘干,只是将培养液甩干,翻转培养瓶加入培养液,孵箱培养2-4小时,轻轻翻转,继续培养。可能有少量组织会浮起,但是不多的。
4、细胞一般3天可以见到了,一周左右长的好的话,就可以传代了。
5、技术熟练的话,贴壁法100ml培养瓶用一只大鼠就可以,还与你取材时动脉的长短有关。摸索方法,建议你用两只大鼠/100ml培养瓶。如果你步入实验阶段,技术熟练,可以一次多用几只大鼠多养几瓶原代细胞。

抱歉,我不养冠脉内皮细胞。
平滑肌细胞是很好养的,不要太着急,慢慢来,你一定会成功的!
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wood533[使用道具]
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10
 
你用酶消化是否仅仅使用胶原酶2,贴块法好像从种入培养瓶到融合太慢了,我想改用酶消化,另外你当时酶消化时消化的程度如何,我见到有文献说把中膜小块消化至胶冻状,按他的消化程度是否消化过头了。详细和我说说如何把握消化的程度。谢谢了
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