【求助】我的MTT怎么了？

细胞世界 » 讨论区 » 经验共享 » 【求助】我的MTT怎么了？

15 1/2 1 2 ››

需要登录并加入本群才可以回复和发新贴

打印 | 推荐 | 订阅 | 收藏

标题:【求助】我的MTT怎么了？

minran_1980[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 75816
精华 1
积分 339
帖子 293
信誉分 102
可用分 2344
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-28
状态离线

发表于 2012-9-29 11:12 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我现在正在做同型半胱氨酸对内皮细胞影响的生长曲线，可是在加MTT后，很快出现紫色，37度4小时后颜色更深，加入DMSO后又变成粉红色。即使在细胞完全死亡组仍呈现粉色，比未加药的对照组酶标值还要高。
而且在单独把MTT加入同型半胱氨酸培养液后也出现紫色。是不是半胱氨酸与MTT可以发生反应？
不知道该怎样确定同型半胱氨酸对内皮细胞影响的生长曲线？
有哪位前辈做过同型半胱氨酸的细胞培养的生长曲线，请尽快指教为盼！

131415[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 74126
精华 0
积分 565
帖子 789
信誉分 100
可用分 4798
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-10-6
状态离线

发表于 2012-9-29 11:13 资料个人空间短消息加为好友

小中大

QUOTE:

原帖由 minran_1980 于 2012-9-29 11:12 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
我现在正在做同型半胱氨酸对内皮细胞影响的生长曲线，可是在加MTT后，很快出现紫色，37度4小时后颜色更深，加入DMSO后又变成粉红色。即使在细胞完全死亡组仍呈现粉色，比未加药的对照组酶标值还要高。
而且在单独把MTT加入同 ...

是不是污染了

minran_1980[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 75816
精华 1
积分 339
帖子 293
信誉分 102
可用分 2344
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-28
状态离线

发表于 2012-9-29 11:14 资料个人空间短消息加为好友

小中大

单独把MTT加入同型半胱氨酸培养液后也出现紫色，加入DMSO后又变成粉红色，所以应该不是污染的问题吧

911[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 73229
精华 1
积分 523
帖子 682
信誉分 102
可用分 4276
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-20
状态离线

发表于 2012-9-29 11:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我做的MTT比较多，第一次听说这种情况，的确奇怪。是不是半胱氨酸与MTT可以发生反应？我想不会，因为相关文献上报道过用MTT法做homocysteine的细胞毒性实验。（请看链接中的几篇摘要：cuturl('http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?CMD=Display&DB=PubMed')）。
个人认为，您的试剂或者操作有问题。下面给您几点建议：
1.首先搞清楚使用的MTT、homocysteine等试剂有无问题；
2.尽可能使用新的96孔板，特别注意，在37度4小时后，必须在1500rpm下离心十分钟，使沉淀完全，然后才可弃上清，加入DMSO。还有每孔内加入细胞的数量要适中。
3.细菌或霉菌等污染不能排除，理由：（1）加入MTT后很快出现紫色。应该不会。有的时候低度污染或是某些微生物污染的时候挺难发现，而且培养的细胞也能生长，这时候就容易出现上述现象，液体肯定是紫色的，倒上清时一块连细菌什么的都倒了，剩下的沉淀就少了，我想这时加入DMSO肯定是粉红色的；（2）单独把MTT加入同型半胱氨酸培养液后也出现紫色。这更是离谱。MTT的原理为活细胞内的线粒体脱氢酶将黄色的可溶性四唑盐MTT还原为紫蓝色不溶结晶formazan，难不成您的培养液内有活细胞？所以我高度怀疑您的同型半胱氨酸培养液被污染了，建议取一点涂片，请一位老手看看，必要时送检验科做细菌培养。您不妨更换培养液试试。
4.生长曲线的测定不止MTT方法一种，直接细胞计数都行，只要认真操作准确性也差不了哪里去，有很多参考书上都有这个方法，在这里就不多说了。
请您按上述要求再做做看，无论什么结果都请继续跟帖讨论。

minran_1980[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 75816
精华 1
积分 339
帖子 293
信誉分 102
可用分 2344
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-28
状态离线

发表于 2012-9-29 11:18 资料个人空间短消息加为好友

小中大

首先对您的帮助表示感谢。
实验中的同型半胱氨酸（Hcy)是从sigma公司购买的，MTT也用过好几次实验了而且同时做别的药物就没变色。96孔板是新的。关于Hcy培养液有无污染，我想不会。因为同时做的另外一种药物一切都正常。不过我也不敢保证绝对没问题，明天按您的建议涂个片子看看吧。

今天，我把其中的一部分细胞在加入MTT前先用培养液清洗了两遍，然后加入培养液后再加MTT,颜色没变，但是酶标时死亡的细胞却比空白组高很多，这种方法恐怕也不行。

做实验可真不容易，刚刚开始就遇到不顺，真不知今后还会遇到什么，多亏有想您这样好心的前辈相助，多谢了！

qqq111[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 73201
精华 0
积分 830
帖子 1238
信誉分 101
可用分 7086
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-20
状态离线

发表于 2012-9-29 11:19 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不过我还是认为有污染。您先涂片或做个细菌培养试试，要是不行就快点跟帖，我再请教一下我实验室的老师，大家一起讨论。

minran_1980[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 75816
精华 1
积分 339
帖子 293
信誉分 102
可用分 2344
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-10-28
状态离线

发表于 2012-9-29 11:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

真的很有意思。我请教了一位实验室的前辈，她也是第一次遇到这种现象。她认为不是污染的问题，因为将半胱氨酸培养液直接与MTT相加不到一分钟即可出现紫色，不用孵育，直接加入DMSO就出现粉色，而且其酶标值随浓度改变成弧形曲线。如果是污染的话，MTT与线粒体的酶结合也需要两小时以上。很快显色的原因，可能是半胱氨酸的巯基与MTT反应所致。建议我直接做细胞计数，用胎盘兰染色。不知道还有没有更简便准确易行的方法，以前介绍过的MTS行吗？真的很简便吗？大约需要多少钱？

feima+[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 77651
精华 0
积分 424
帖子 547
信誉分 100
可用分 3561
专家分 0
阅读权限 255
注册 2011-11-19
状态离线

发表于 2012-9-29 11:21 资料个人空间短消息加为好友

小中大

不好意思，这两天实验做的比较疲劳，没发现您的跟帖，抱歉！
您是搞营养研究的是吗？我们实验室有个博士也在用MTT法测同型半胱氨酸培养细胞的什么指标，好象没有这个问题嘛，明天我再问一下她以及实验室的资深技术员，看看是什么问题。
另外，您说的MTS法我没听说过，因为我对MTT法的印象不好，所以干脆用的直接计数法做的生长曲线，我想只要操作得当也是可以的，您要是需要我就上传。

caihong[使用道具]
四级
Rank: 4

UID 73197
精华 1
积分 795
帖子 1206
信誉分 102
可用分 6856
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-9-20
状态离线

发表于 2012-9-29 11:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

我作了好长时间的MTT，的确不怎摸样，还是用H3-TDR掺入发吧

bgf5[使用道具]
三级
Rank: 3

UID 76186
精华 1
积分 430
帖子 435
信誉分 102
可用分 3111
专家分 10
阅读权限 255
注册 2011-11-2
状态离线

发表于 2012-9-29 11:22 资料个人空间短消息加为好友

小中大

今天我和实验室的那位做同型半胱氨酸的博士谈了一下，她在做MTT时没有您这个问题，而且她提到，如果是污染的话，可能会出现加入MTT后马上变紫的现象。顺便公布一下她的营养液是Sigma公司购买的无蛋氨酸和半胱氨酸的RPMI培养液，使用时加入同型半胱氨酸。
另外请您告诉我一下您在96孔板内培育细胞的时间（在加MTT前），注意观察细胞的形态。因为有时培育24小时很难发现细胞污染，而48小时后就可看到污染的表现，希望您留心。还有您的培养液组成也请介绍一下。

15 1/2 1 2 ››