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标题:【求助】关于核型分析

utt0989[使用道具]
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发表于 2012-10-1 21:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大

【求助】关于核型分析

试验需要，现需对培养的细胞进行染色体计数。已经做过4次，要么是染色体散得不够，无法计数，要么是细胞膜在两次固定，离心的过程中就破裂， 染色体成乱糟糟的团。希望有经验的同学给一些好的建议。当然如果有谁经常做，能否给带上一个样品。 万分感激。

我的实验步骤：
1 用硅化瓶子将中期细胞收集，800转5分钟离心。
2 4毫升 0。075M的KCL低渗30分钟,( 细胞吹散，处理时应该放在37度条件。)
3 （离心前先加1毫升固定液预固定）离心。缓慢加固定液
4 4度条件处理20分钟，离心。
5 加新鲜的固定液，再次固定
6 冰冻处理的净化玻片，5-50cm 高处垂直滴一滴，快速过火。
7 加一滴Gimesa 染液，染色10分钟
8 上机观察
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发表于 2012-10-1 21:00 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大


QUOTE:
原帖由 utt0989 于 2012-10-1 21:00 发表 bbcodeurl('http://bbs.antpedia.com/images/common/back.gif', '%s')
试验需要，现需对培养的细胞进行染色体计数。已经做过4次，要么是染色体散得不够，无法计数，要么是细胞膜在两次固定，离心的过程中就破裂， 染色体成乱糟糟的团。希望有经验的同学给一些好的建议。当然如果有谁经常做，能否给带上 ...

我们的步骤稍有不同：
１。秋胺处理，消化，离心收集，PBS洗一次
２。低渗KCL处理。时间在不同细胞不大一样一般20-40min
3. 滴加少量固定液，（1/10体积）离心1500rpmX5min
4.去上清，保留１ml上清，轻轻拍打悬起，缓慢加入固定液，边加边振荡,直至满管。离心1500rpmX5min
5. 去上清，保留１ml上清，轻轻拍打悬起，缓慢加入固定液，边加边振荡,直至满管。静置15min, 离心1500rpmX5min
6.去上清，轻轻拍打悬起，缓慢加入固定液，边加边振荡,直至满管。4C过夜，离心去上清
７。滴片。载玻片要放在０Ｃ冰水浴。取出玻片不要等玻片温度上升就从高处滴片
８。用口呵气镜下观察。
９。染色

据一个来我们这里的加拿大老太太说在此过程中，点片后的温度和湿度是关键，不同地方，不同季节都不一样。
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utt0989[使用道具]
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发表于 2012-10-1 21:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
对园丁的全力帮助表示衷心的感谢。您的实验方案里，固定液加满以后直接离心吗？
另外有两个小细节， 细胞在低渗前需要吹打均匀，否则细胞成团；细胞在固定液中离心离 不下来， 你们是否碰到这个问题，如何解决？
盼望您的回复！
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发表于 2012-10-1 21:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
您的实验方案里，固定液加满以后直接离心吗？
另外有两个小细节， 细胞在低渗前需要吹打均匀，否则细胞成团；细胞在固定液中离心离 不下来， 你们是否碰到这个问题，如何解决？
盼望您的回复！

——————————————————————————————————————————————————————————————

１。静置15min，关键是固定液不是突然加的，而是逐渐加入的。一步一步替着来的。
２。低渗前一定要吹打彻底，我们再加kcl时，先加１ml，用力拍打均匀后再继续加，不要怕细胞会破，因为这一步本来就是为了把细胞搞破。

细胞成团最麻烦了，根本摔不出染色体来，即便有染色体周围细胞碎屑那么多往往照相不好看。

染色体操作和分生不一样，分生是东西越新鲜越好，遗传操作就要旧货。
染色体最好老化几天再染色，也有37C干烤过夜的。
吉姆萨也当然要老，新鲜的不行，最好配过１－２年的，至少半年以上。
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发表于 2012-10-1 21:01 资料 个人空间 短消息  加为好友 

 小中大
我的一个小经验是:
只固定一次,在冰上固定45分钟以上. 因为有些细胞,多次固定和离心会造成细胞破碎,染色体外流,而且细胞损失也多. 一次固定45分钟以上, 效果也不错.你不防试试.
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utt0989[使用道具]
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 小中大
请教各位,固定液固定后离心细胞离不下去，1500rpm/5min,你没有碰到这个问题吗？ 是如何解决的？
非常感谢！！
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园丁##[使用道具]
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 小中大
固定液固定后离心细胞离不下去，1500rpm/5min,你没有碰到这个问题吗？

————————————————————————————————————————————————————————————————

我遇见过，我觉得不沉淀的是胀破的鬼影细胞。细胞核会沉淀的。
而且，我经常的问题是收获的细胞核太多了，作出的染色体很多叠杂在一起，
所以，这个问题我不解决，不沉淀就不沉淀，反正最后够我用的就可以了。
开始用增加离心时间的方法解决，后来发现不值得，鬼影细胞沉淀也会增加，摔完片子满眼的鬼影细胞找不到很好的视野。后来我便不再强求，时间根据培养状态细胞多少，能短就短，最后够摔10张片子就够了.

祝你好运，
这个试验我做的也不是很好，还望有高手出面
做分生时很有自信，做这个每次都如履薄冰，不踏实，
－－唉……还是技术不够好
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ffooll[使用道具]
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 小中大
请问你是做单纯的染色体记数还是要看核型分析?
我的个人体会如下:
1细胞要养得好,要大部分处于分裂中期,贴壁细胞是圆而凸起,透亮的那种;
血细胞接种后72小时就差不多了;
2加秋水仙胺/碱,结合细胞密度,密度大,就多点,稀就少点;这要摸条件;
3离心速度2000rp/min,更好的使细胞沉降下来;
4固定液要新鲜配制;
5低渗要吹打充分,让细胞膜破裂,释放出染色体;
6加固定液后的吹打要轻柔,混匀,若是吹打过度,染色体会很散开,不利于分析;
7滴片不一定要很高,只要能均匀滴在片两边让染色体舒展开,5cm的高度亦可;
8染色时间和消化时间要反复摸索,可先试部分片子染色不同的时间,不同 的 消化时间,寻找最佳效果;
9染料我是一配就用3个月到半年.
希望对你有所帮助,成功了,上传张片子给大伙瞧瞧,
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utt0989[使用道具]
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 小中大
谢谢你啊！其实，我已经猜到你就是能离下多少就多少的态度。我师姐建议我， 在固定后离心时加一定量的PBS,很多细胞都能离下来。不过不知这样是否会影响结果。因为我至今没有做出特别漂亮的结果。
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 小中大
我仅对染色体计数。
其实有一个问题， 我觉得我的理解与你和eeflying的都不一样。 我认为低渗只是将细胞胀大，而没有将细胞膜胀破。不知我的理解是否正确。
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